刘磊，刘健，万磊

(1.湖北中医药大学，武汉 430065; 2.安徽中医学院第一附属医院风湿科)



·论著·

强直性脊柱炎患者血小板参数和外周血B、T淋巴细胞衰减因子及调节性T细胞变化

刘磊1，刘健2，万磊2

(1.湖北中医药大学，武汉 430065; 2.安徽中医学院第一附属医院风湿科)

[摘要]目的观察强直性脊柱炎(AS)患者血小板参数的变化及外周血B、T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、调节性T细胞(Treg)的表达。方法选取60例AS患者，检测患者血小板参数，采用流式细胞术检测外周血BTLA及Treg的表达，观察AS患者血小板变化及其影响因素。结果AS患者存在血小板参数异常变化，表现为PLT、PCT的升高。与正常组比较，AS患者外周血BTLA及Treg的表达降低；与BTLA正常者比较，BTLA异常组血小板参数PLT、PCT升高；与Treg正常者比较，Treg异常者血小板参数PLT、PCT升高，MPV降低(P<0.05 or P<0.01)。血小板参数与BTLA、Treg及C3、hs-CRP、IGG存在一定相关性(P<0.05 or P<0.01)。结论AS患者外周血BTLA、Treg表达降低可能是引起血小板参数异常的原因。

[关键词]脊柱炎,强直性；血小板功能试验；T淋巴细胞,调节性 ; 血沉

血小板不仅参与凝血与止血过程，血小板及其活化产物如血小板颗粒、肿瘤坏死因子、生长因子等多种活性分子均参与了机体的炎性反应过程，并与众多免疫性疾病的病情密切相关[1]。强直性脊柱炎(AS)是一种慢性、进行性、自身免疫性炎性疾病，该病以骶髂关节及中轴关节炎性病变为主要临床特征，并伴有血液系统、心脏、肺部、神经系统等关节外病变损害[2-4]。该病的发病机制目前尚未明确。研究表明，B、T淋巴细胞衰减因子(BTLA)及调节性T细胞(Treg)参与了类风湿关节炎等多种自身免疫性疾病的发病过程[5-7]。本研究观察了60例AS患者血小板参数、BTLA及Treg的变化，以探讨血小板在AS病变中的意义及作用机制。

1对象与方法

1.1研究对象从2011年7月至2012年10月安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院患者中选取60例AS患者，其中男41例，女19例，男：女约为2∶1；年龄18～60岁，平均年龄(35.0±10.7)岁；病程0.5～30年，平均病程(7.17±6.30)年。另设20例为健康对照组(NC组),男12例，女8例，男：女为3：2；平均年龄为(41.9±11.7)岁，均来自安徽中医学院第一附属医院体检中心，经体检和免疫学检查排除自身免疫性疾病，均为身体健康、无明显器质性疾病者。设计、实施、评估者：全部为作者，均受过正规培训，未采用盲法评估。本研究方案经医院伦理委员会批准，且经患者知情同意。

1.2诊断标准参照1987年美国风湿病学会(ARA)修订的AS诊断标准[8]。

1.3纳入标准①符合上述诊断标准；年龄在18～60岁之间；③自愿参加本研究,并签署知情同意书。

1.4排除标准有下列以下情景者，不纳入本次研究：①患者合并有影响血小板数量的疾病，或严重心、肝、肾等重要脏器疾病和血液、内分泌疾病者；②不符合年龄标准者；③妊娠期及哺乳期女性；④精神行为异常者。

1.5检测方法

1.5.1BTLA的检测取AS患者全血100 μL，加入BTLA 10 μL。置样品于室温避光染色30 min。加入溶血素3 mL，室温避光10 min，离心5 min，弃上清。加入2 mL PBS洗涤2次，以含1%多聚甲醛的PBS重悬，使用FACSAria 流式细胞仪检测分析BTLA占淋巴细胞(LC) 百分比。藻红蛋白(PE) 标记的BTLA试剂盒购于美国贝克曼公司。

1.5.2Treg的检测分别采集RA患者外周静脉血2 mL，肝素抗凝；取肝素抗凝的全血100 μL，加入小鼠抗人CD4-FITC 10 μL、CD25-PE 5 μL、CD127-PE-Cy5 10 μL，室温闭光反应30 min；加2 mL溶血剂在室温下溶解红细胞，室温闭光约10 min；PBS洗涤2次，离心5 min(1500 r/min)，弃上清。

1.5.3血小板参数的检测用日本SysmexXT-2000i全自动血细胞分析仪检测血小板参数：血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、血小板分布宽度(PDW) 、血小板平均体积(MPV)，测定方法采用酶联免疫吸附法。

1.5.4实验室指标的检测红细胞沉降率(ESR)采用魏氏法检测；C反应蛋白(CRP)、IgG、IgA、IgM、C3、C4采用HITACHI 7060全自动生化仪检测。

1.6统计学处理采用SPSS17.0统计学软件分析数据,两组间计数资料比较采用χ2检验；实验数据为连续性变量采用正态性和方差齐性检验，两组间比较采用t检验；相关性分析采用Spearman分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1血小板参数变化在AS组中的异常率见表1。

表1　AS组与NC组血小板异常率比较[例(%)]

注：与NC组比较,aP<0.01，bP<0.05

2.2AS患者血小板参数与BTLA、Treg及其他实验室指标的相关分析血小板参数PLT与CD3+BTLA+T cell、CD4+BTLA+T cell、Treg成负相关；PCT、PDW与CD8+BTLA+T cell成负相关；MPV与CD4+BTLA+T cell成正相关；PLT与C3、hs-CRP、IGG成正相关；PCT与IGG成正相关(P﹤0.05或P﹤0.01),见表2。

表2　AS患者血小板参数与实验室指标的相关性分析

注：aP<0.05,bP<0.01

2.3AS患者外周血血小板、BTLA、Treg及实验室指标变化与正常组比较，AS组患者血小板参数PLT、PCT显著升高(P<0.05或P<0.01)；外周血CD3+BTLA+T cell、CD4+BTLA+T cell、CD8+BTLA+T cell、Treg的表达频率显著降低(P<0.05或P<0.01)，见表3。

2.4AS患者外周血BTLA、Treg异常者血小板参数变化与BTLA正常者比较，BTLA异常组血小板参数PLT、PCT升高；与Treg正常者比较，Treg异常者血小板参数PLT、PCT升高，MPV降低(P﹤0.05或P﹤0.01)，见表4。

组别例数CD3+BTLA+Tcell(%)CD4+BTLA+Tcell(%)CD8+BTLA+Tcell(%)Treg(%)血小板参数PLT(×109/L)PCT(%)PDW(fL)MPV(fL)正常组2044.75±4.7479.28±6.3974.84±11.486.71±1.75154.30±34.6325.2±2.813.83±2.2611.34±1.01AS组6029.10±6.69a48.90±5.97a51.77±16.92a5.68±1.36a251.38±61.64a27.3±4.2b13.28±2.3710.83±1.11

注：aP<0.01,bP<0.05

组别例数BTLAPLT(×109/L)PCT(%)PDW(fL)MPV(fL)TregPLT(×109/L)PCT(%)PDW(fL)MPV(fL)正常组14163.87±51.3924.0±4.613.18±1.5010.61±1.10203.68±77.7226.1±5.112.86±1.5111.57±1.00异常组46268.31±33.41a29.2±3.7a12.98±1.5511.03±0.87248.63±52.86a28.9±3.8b13.14±1.5410.94±0.85b

注：与正常组比较，aP<0.01,bP<0.05

3讨论

本研究表明AS组患者血小板参数PLT、PCT显著升高。PLT是反映外周血小板生成及衰亡的动态指标，PCT反映了单位容积的全血中血小板体积所占比例，也是监测血小板较为灵活的指标，MPV代表平均血小板大小。PLT一般与PCT及MPV的变化一致[9]。而在同属自身免疫性疾病的RA病变过程中，血小板参数PLT、PCT增高在一定程度上反映了关节滑膜侵蚀性炎症的活动程度[10]。相关性分析表明，AS患者PLT与CD3+BTLA+T cell、CD4+BTLA+T cell、Treg成负相关；PCT、PDW与CD8+BTLA+T cell成负相关；MPV与CD4+BTLA+T cell成正相关；表明T淋巴细胞免疫功能失调可能参与了血小板参数的异常升高。PLT与C3、hs-CRP、IGG成正相关,PCT与IGG成正相关。说明调节性T细胞，BTLA，补体系统、免疫球蛋白系统可能共同参与并导致了AS患者血小板参数的异常升高。异常升高的血小板活化生成大量趋化因子与血小板活化因子，招募单核巨噬细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞等与血小板相互聚集、黏附[11]，使机体产生、维持炎性反应，进而引起中轴关节肌腱、韧带及骨附着点纤维化与软骨骨化，最终导致关节强直，功能受限。

本研究表明，与BTLA、Treg正常者比较，AS患者BTLA异常组PLT、PCT升高；Treg异常组，MPV降低。提示BTLA及Treg可能直接或间接参与了AS患者血小板参数的异常改变。BTLA是免疫球蛋白超家族中新近发现的抑制性分子，对T细胞活化、增殖具有负性调节作用[12-14],并在CD4+T细胞外周免疫耐受过程中起着很重要作用[15]。Treg负性调节T淋巴细胞的活化与增值，Treg可以通过直接接触、释放细致性细胞因子(IL-35)、颗粒酶杀伤CD4+、CD8+T 细胞、B细胞与单核细胞[16-17]。当BTLA及Treg表达降低，T细胞产生异常活化，部分T细胞产生大量多种致炎性细胞因子，造成滑膜及骨关节软组织的不同程度损伤或破坏；而部分T细胞活化后激活B细胞，产生大量补体如C3、C4等和IgM、IgG、IgA等，异常表达的补体及免疫球蛋白直接或间接参与抗原结合形成免疫复合物，引发炎性反应从而加重了血液系统的损伤，进一步导致血小板参数异常升高。

综上所说，强直性脊柱炎患者存在血小板参数的异常改变，表现为PLT、PCT的显著升高。AS患者血小板参数变化的机制与BTLA及Treg密切相关。其机制可能是AS患者外周血BTLA及Treg低表达引发对T细胞的负性调节降低，异常活化的T细胞可激活补体系统并释放大量炎性因子，引发炎性因子失衡，进而引发血小板参数的异常改变。

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The changes of platelet parameters,BTLA and Treg in peripheral blood in patients with ankylosing spondylitisLiuLei*,LiuJian,WanLei(*HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430065,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the changes of platelet parameters,BTLA and Treg in peripheral blood in patients with ankylosing spondylitis.MethodsSixty patients with ankylosing spondylitis were slected.Biochemical analyzer was used to measured platelet parameters and other laboratory parameters,using flow cytometry to determinate BTLA and Treg expression in peripheral blood.The platelet parameters changes and the correlate with other parameters were observed.ResultPLT,PCT of ankylosing spondylitis patients were increased.Compared with normal control,BTLA and Treg expressing of AS patients were reduced significantly.Compared with BTLA normal group,PLT and PCT of AS patients were increased in BTLA abnormal group.Compared with Treg normal group,PLT and PCT of AS patients were increased and MPV reduced significantly in BTLA abnormal group(P<0.05 or P<0.01).The platelet parameters and BTLA,Treg were correlated with C3,hs-CRP,IGG(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe platelet parameters abmormalities maybe related to the imbalance of BTLA and Treg expression in patients with ankylosing spondylitis.

[Key words]Spondylitis,ankylosing；Platelet function tests；T-lymphocytes,regulatory;Blood sedimentation

(收稿日期：2015-02-09)

Corresponding author:Liu Jian,Email：liujianahzy@126.com

中图分类号:R593.23

文献标识码:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.01.003

作者简介：刘磊，博士在读，Email:dr_tcm_liu@126.com通信作者：刘健,博士，主任医师，教授，博士生导师,Email：liujianahzy@126.com

基金项目:国家中医药重点学科中医痹病学建设项目(国中医药发[2009]30号)；安徽省科技厅科研计划项目(09020304046)；安徽省卫生厅中医药科研项目(2009ZY05)；安徽中医学院科技创新团队项目(2010TD005)。