李琪儿+叶国良+郭俊明

[摘要] 目的 了解Rab27B mRNA在胃癌组织和胃癌前病变组织中的表达情况及及其临床意义。 方法 应用实时定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术检测胃癌组织及配对的癌旁组织中Rab27B mRNA的表达量；应用qRT-PCR技术检测胃癌前病变组织及配对的正常胃黏膜组织中Rab27B mRNA的表达量。 结果 Rab27B mRNA不仅在胃癌组织中表达降低（P=0.009），而且在胃癌前病变组织中表达也降低（P=0.013）。Rab27B mRNA在胃癌组织中的表达量较癌旁组织平均降低1.8倍。Rab27B mRNA的表达量与胃癌的分化程度有关（P=0.009）。 结论 Rab27B mRNA可能参与了胃癌的发生，具有成为胃癌肿瘤标志物的潜在价值。

[关键词] Rab27B；胃癌；胃癌前病变；肿瘤标志物

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）26-0004-04

Expression and its clinical significance of Rab27B mRNA in gastric cancer and gastric premalignant lesions

LI Qier1 YE Guoliang1 GUO Junming2

1.Department of Gastroenterology， the Affiliated Hospital of Ningbo University School of Medicine， Ningbo 315020， China；2.Ningbo University School of Medicine， Ningbo 315211， China

[Abstract] Objective To understand the expression of Rab27B mRNA in gastric cancer and gastric premalignant lesions and its clinical significance. Methods Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（qRT-PCR） was used to detect Rab27B mRNA expression in gastric cancer tissues and adjacent non-tumorous tissues. Then， Rab27B mRNA expression in gastric premalignant lesions and matched normal tissues were explored. Results Rab27B mRNA was not only significantly down-regulated in gastric cancer tissues（P=0.009）， but also decreased in gastric Premalignant lesions（P=0.013）. Compared to paired adjacent normal tissues， Rab27B mRNA was down-regulated with an average level 1.8-fold in cancer tissues. The expression level of Rab27B mRNA was closely correlated with poor differentiation（P=0.009）. Conclusion Rab27B mRNA may play important role in gastric cancer initiation and it has potential capacity to be tumor marker for gastric cancer.

[Key words] Rab27B； Gastric cancer； Premalignant lesion； Tumor marker

我国是胃癌高发地区，其发病率居恶性肿瘤第2位，死亡率居恶性肿瘤死因第3位[1]。早期诊断对胃癌的预后起着至关重要的作用。早期胃癌的5年生存率可达90%以上，而进展期胃癌则不足50%[2-3]。由于传统的肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）等诊断胃癌的灵敏度和特异度均不高，因此有必要寻求新型的生物学标志物。Rab27B是致癌基因RAS家族成员之一，目前已发现其与肝癌、乳腺癌、结肠癌相关[4-6]。我们应用实时定量逆转录-聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction， qRT-PCR）技术检测了Rab27B mRNA在胃癌组织和胃癌前病变组织中的表达量，并分析其与胃癌患者临床病理因素的关系，为Rab27B mRNA成为胃癌筛查和早期诊断的标志物提供了重要的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

从2012年12月～2014年4月于宁波大学医学院附属医院和鄞州人民医院共收集胃癌组织101例、胃癌前病变组织30例。101例胃癌患者中男73例，女28例，年龄39～81岁，平均（64.2±9.5）岁。30例胃癌前病变患者中男18例，女12例，年龄38～81岁，平均（60.8±10.4）岁。所有胃癌患者均经过外科手术，术后病理确诊胃癌，且术前均未接受任何放化疗；所有胃癌前病变患者均经过内镜黏膜下剥离（endoscopic submueosaI dissection，ESD）术，术后病理确诊胃黏膜中重度异型增生。用于本实验研究的人体标本均事先由患者或其委托人签署知情同意书并得到了宁波大学医学伦理委员会的批准。采集所有病变组织标本的同时采集相应的距离病灶大于5 cm处正常组织1份，采集的新鲜组织标本立即浸泡于无氮样品保存液中，-80℃下保存备用。

1.2 试剂

无氮样品保存液购自北京百泰克生物技术有限公司；Trizol试剂购自德国Invitrogen公司；GoScriPt逆转录试剂盒和GoTaqR qPCR Master Mix试剂盒均购自美国Promega公司。

1.3 实验方法

应用Trizol法抽提组织总RNA，提取的总RNA用紫外分光光度计测定浓度并检测质量。A260/A280在1.8～2.0范围内可认为总RNA纯度可靠。取2 μg总RNA用于逆转录合成cDNA，逆转录反应采用GoScriPt逆转录试剂盒。所获得的cDNA稀释5倍后作为模板，采用GoTaqR qPCR Master Mix试剂盒，在Mx3005P荧光定量PCR仪（Srratagene公司）上检测Rab27B mRNA的表达量。Rab27B mRNA的引物序列：上游：5'-AGGCTATTCTCTGGGATGAGTG-3'，下游：5'-TCTGCTGTATTTAAGGGCACAA-3'；外参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的引物序列：上游：5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3'，下游：5'- TGTTGC TGTAGCCAAATTCGTT-3'。扩增条件设定：95℃ 5 min（预变性），94℃ 15 s（变性），54℃ 30 s（退火），70℃ 30 s（延伸）。循环40次。

1.4 结果判定

采用ΔCt法计算Rab27B mRNA相对表达量。计算公式：ΔCt=Ct（Rab27B）-Ct（GAPDH），ΔΔCt=Ct（实验组）-Ct（对照组）。ΔCt值越小则表达量越高。实验组是指胃癌组织及癌前病变组织，对照组是指相对应的癌旁组织和正常组织，实验组目的基因的表达量相对于对照组变化的倍数用2ΔΔCt来表示。

1.5 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行分析，分别采用两独立样本t检验（unpaired students t-test）、配对样本t检验（paired students t-test）和方差分析（ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Rab27B mRNA在胃癌组织中的表达情况

应用qRT-PCR技术检测101对胃癌组织和配对癌旁组织中Rab27B mRNA的表达量，结果显示，Rab27B mRNA在胃癌组织中的表达量显著低于癌旁组织（P=0.009，封三图3），平均降低1.8倍。61%（62/101）胃癌组织中Rab27B mRNA的表达量低于癌旁组织。

2.2 Rab27B mRNA在胃癌前病变组织中的表达情况

应用qRT-PCR技术检测30对胃癌前病变组织和配对正常组织中Rab27B mRNA的表达量，结果显示，Rab27B mRNA在胃癌前病变组织中的表达量也显著降低（P=0.013，封三图4）。

2.3 Rab27B mRNA的表达量与胃癌患者临床病理因素的关系

进一步比较Rab27B mRNA水平与胃癌患者临床病理因素的关系，包括年龄、性别、TNM分期[7]、浸润深度、肿瘤大小、分化程度和淋巴结转移情况。结果显示，Rab27B mRNA水平与胃癌的分化程度相关（P= 0.009，表1），其表达水平越低，则分化程度也越低。

表1 Rab27B mRNA的表达水平（ΔCt）与胃癌患者临床病理因素的关系（x±s）

3 讨论

目前我国的早期胃癌诊断率不足10%[8]。胃癌的诊断主要依靠内窥镜检查，由于内窥镜检查的有创性注定其不适于广泛筛查。有文献报道，大范围筛查有助于提高早期胃癌的检出率[9]。理想的筛查手段不仅要具备无创、快捷、经济等特点，还应该具备高灵敏度和特异度，但传统的肿瘤标志物如CEA，它的灵敏度和特异度分别仅为30%[10]和23.2%[11]。为此，我们希望能够发现更为理想的候选肿瘤标志物。

Rab蛋白属于Ras家族的小GTP酶，参与和调节囊泡的运输[12]。Rab27由Rab27A和Rab27B组成。相对于Rab27A，Rab27B的表达更为局限，主要表达于脑垂体、膀胱、结肠、胃和胰腺[13-16]。

研究最早的是Rab27B与乳腺癌的关系。Hendrix等[4]发现Rab27B调节雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性的乳腺癌细胞侵袭性生长和转移，Rab27B的高表达与乳腺癌的不良预后密切相关。此后又有研究显示Rab27B的高表达与乳腺癌的淋巴结转移、临床分期晚、病理分型恶性程度高有关，Rab27B表达量高的患者生存期较短[17]。新近研究发现结肠癌组织中Rab27B的表达量均明显高于癌旁组织，且Rab27B蛋白的表达与淋巴结转移、远处转移和TNM分期有关[5]。但Rab27B却被证实在原发性肝癌组织中的表达量较癌旁组织降低[6]。我们的研究发现Rab27B mRNA在胃癌组织中的表达也降低。由此可见，Rab27B既可作为致癌基因又可作为抑癌基因，其在胃癌和肝癌中的作用机制可能不同于乳腺癌和结肠癌。我们进一步分析了Rab27B mRNA的表达量与胃癌患者临床病理因素的关系，结果发现Rab27B mRNA的低表达与分化程度低有关。

胃黏膜异型增生是胃黏膜发生癌变的关键阶段，被认为是胃癌前病变[8]，目前已有研究发现很多癌症相关基因在癌前病变组织中已出现了异常表达。Gibb等[18]进行了一项人类口腔黏膜癌及癌前病变的lncRNA表达图谱，发现在癌组织中异常表达的lncRNA中有60%在癌前病变组织中也存在异常表达。Shao等[19]证实HMlincRNA717在胃癌组织和胃黏膜异型增生组织中的表达量均较正常黏膜降低。屈王蕾等[20]通过免疫组织化学法检测ToPoⅡα蛋白在正常宫颈组织、宫颈癌癌前病变组织-宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宫颈鳞癌组织中的表达，结果发现TopoⅡα蛋白表达在CINⅡ、CINⅢ和宫颈鳞癌组织中上调。本研究发现Rab27B mRNA不仅仅在胃癌组织中低表达，而且在胃癌前病变组织中也表达降低，说明Rab27B可能在胃癌的发生过程中起重要作用。

综上所述，Rab27B mRNA在胃癌组织及胃癌前病变组织中均呈现低表达，有可能成为胃癌筛查和早期诊断的新型标志物。

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（收稿日期：2015-05-18）