原晓龙,陈剑,张传光,毕玮,王娟,王毅

(1.云南省林业科学院，云南　昆明650201;2.云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，

国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，云南　昆明650201；

3.云南农业大学，资源与环境学院，云南　昆明650201)



长松萝中非核糖体肽合成酶NRPS基因克隆与鉴定*

原晓龙1,2,陈剑1,2,张传光3,毕玮1,2,王娟1,2,王毅1,2

(1.云南省林业科学院，云南昆明650201;2.云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，

国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，云南昆明650201；

3.云南农业大学，资源与环境学院，云南昆明650201)

摘要：非核糖体肽具抗生素、抗病毒、抗癌及免疫抑制剂等重要的药用价值。以长松萝的地衣型真菌为研究材料，通过同源克隆和Gene walking的方法获取长松萝地衣型真菌全长非核糖体肽合成酶基因(UsNRPS)，并对得到的UsNRPS进行生物信息学分析、分子系统进化分析及基因表达分析。结果表明：在地衣型真菌中，非核糖体肽在长松萝中为首次发现，BLAST比对表明其为NRPS基因的A结构域，生物信息学分析显示UsNRPS蛋白是一种非分泌蛋白，位于细胞质基质中；分子进化分析显示UsNRPS与埃默森蓝状菌(Rasamsoniaemersonii)的NRPS基因的A结构域蛋白聚为一类；RT-PCR分析表明：2 %肌醇、10 %甘露醇、2 %山梨醇、2 %葡萄糖、10 %葡萄糖、0.2 %谷氨酰胺、1 %甘氨酸、0.2 %丙氨酸能够诱导NRPS基因的轻微表达，2 %、10 %蔗糖和果糖均能诱导NRPS基因的强烈表达；0.2 %、1 %的天冬氨酸均抑制NRPS基因的诱导表达。

关键词：长松萝；NRPS；基因克隆；生物信息学分析；分子系统进化分析; 诱导表达

非核糖体(non-ribosomal peptides,NRPS)是一种在细菌和真菌中通过非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptides synthetases,NRPS)途径合成的一系列的小分子肽类化合物[1]。NRPS的结构复杂、后修饰途径多样化及具有广泛的生物活性[1～2]。NRPS广泛应用于多肽类抗生素、免疫抑制剂药物、生物表面活性剂、抗癌药物、细胞生长抑制剂和抗病毒药物等[3]，如用于革兰氏阳性细菌感染的Cubicin(达托霉素)[4]，能有效抑制肿瘤细胞生长及扩散的Blenoxane(博来霉素)[5]。多肽骨架肽链的合成由非核糖体肽合成酶(NRPS)催化。NRPS是一种由多模块组成的酶，不同的模块按照起始、延伸和终止的空间顺序排列而成[6]，每个模块均有腺苷酰化结构域(A结构域)，肽酰载体蛋白结构域(T结构域)和缩合结构域(C结构域)3个核心结构域[7]，特定的结构域具特定的酶活性[8]，已发现的NRPS有线型(A型)、重复型(B型)和非线性(C型)3种[9～10]。NRPS在催化合成新肽链过程中，A结构域特异性识别特定氨基酸，以ATP为能量将其活化为氨酰基-AMP中间物[11～12]，功能类似于氨酰tRNA合成酶、乙酰CoA合成酶(Acetyl CoA synthetases，ACS)、4-香豆酸-CoA连接酶(4-counarate coenzyme A ligase,4CL)等[13]。虽然NRPS A结构域与氨酰tRNA合成酶催化相似的反应[14]，但它们在进化或结构上并没有关系，而与ACS、4CL同属于酰苷酸合成酶超家族[7]。腺苷酰化结构域(A结构域)是NRPS的核心保守模件，在催化NRPS合成过程中起着重要的启动和决定作用[15]，在A结构域中有1个约100个氨基酸残基的小C端和1个约400个氨基酸残基的大N端[14]。A结构域具有多种不同的片段，不同的片段专一选择特定的氨基酸，进而决定了NRPS的功能和生物活性的多样性[16]。

地衣是由真菌(子囊菌或担子菌)与共生藻〔蓝藻(Cyanobacteria)〕共生形成的具高度遗传稳定性、结构特殊的一类生物有机体[17～18]。地衣的次生代谢产物一般由共生真菌产生，具抗氧化、抗辐射、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等独特活性，还可作为植物生长抑制剂等[19]，在药用天然产物开发领域具广阔的应用前景。在自然界地衣生长极其缓慢，目前尚难以通过人工培养获得具生物活性的地衣次生代谢产物。在医药应用方面，天然药物具有得天独厚的优势，但限于原料的供应和产量，药物的价格往往较高，且对生态的破坏较为严重。利用基因挖掘技术，发掘与其产物相关的基因，利用组合生物合成的方法可有效改善这一现状，如李晶等[20]将白桦脂酸的关键调控基因HFA1、HMG1和ERG9克隆出来，并将脂肪酸和萜类前体合成途径整个代谢通路装入酵母细胞，使白桦脂酸的合成的生物量显著提高。在细菌和真菌中，NRPS基因广泛存在，王晗等在黑茶的散囊菌属(Eurotium)中检测到NRPS基因片段的存在[21]；NRPS基因在海洋微生物中也广泛存在[22～23]，极地微生物中也已发现NRPS基因的存在[24]。目前在地衣中尚没有关于非核糖体多肽合成酶相关的报道。本研究拟从基因出发，通过Gene walking克隆地衣的NRPS相关基因，用半定量PCR检测不同碳氮源添加物对NRPS基因表达的影响，为利用地衣基因资源和开发潜在的地衣NRP化合物奠定基础。

1材料与方法

1.1　试剂和材料

长松萝(Usnealongissima)地衣型真菌由韩国地衣资源中心提供，于MYA培养基上15℃条件下培养，定期转接。MYA培养基配方为麦芽糖提取物20 g，酵母提取物2 g，琼脂8 g，用水定容至1 000 mL。pEASY-T3克隆试剂盒及Trans1-T1 感受态细胞 (北京全式金公司)；TaKaRaLA Taq酶、Prime Script 1stStand cDNA Synthesis试剂盒 (大连宝生物工程有限公司)；TRIzol试剂、Tiangen 2×Taq酶 (上海生工生物公司)；所用的引物由华大基因合成。

1.2　实验方法

1.2.1基因片段的同源克隆

2014年12月，收集长松萝地衣型真菌菌丝团，用植物提取试剂盒提取其基因组DNA。利用在线简并引物设计软件Gene Fisher (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/)，设计简并引物(表1)，以其基因组DNA为模板进行巢式PCR扩增。PCR体系和反应程序参考王毅等[25]的体系，稍加改动。1 %琼脂糖凝胶电泳检测。

将PCR产物回收纯化后连接到克隆载体pEASY-T3上，转化到Trans1-T1感受态细胞中，进行蓝白斑筛选。从转化的平板中挑选白斑，接种到0.5 mL的液体培养基中，200 r/min，37℃培养12 h后，进行菌落PCR检测，筛选含插入片段的克隆，送到上海生工进行测序。根据测序结果，设计特异引物(表1)，以地衣型真菌的DNA为模板，采用TAKARA的Genome Walking Kit试剂盒克隆获得UsNRPS基因全长。

1.2.3UsNRPS基因的生物信息学分析

将测序结果用DNAman去除载体后，通过NCBI对其DNA序列和氨基酸序列进行BLAST比对分析，选择同源性较高的序列并用MEGA 6.0软件进行聚类分析；理化性质的预测借助于ProParam在线工具；信号肽预测利用SignalP 4.1 server；用Target P预测其亚细胞定位，用NCBI中的Conversed Domain Database数据库搜索NsNRPS的结构功能域；利用Swiss-Model在线工具分析蛋白质的三维结构，并用Procheck在线工具构建拉氏构象图，检测其合理性。生物信息学所用在线工具及其网址见表2。

1.2.4UsNRPS基因的半定量表达分析

将收获的长松萝菌丝团分别接种在添加了不同碳氮源的MYA基本培养基上。碳源分别为肌醇、甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖和果糖，按照2 %和10 % (V/W) 2个不同浓度分别加入基本培养基MYA中。氮源分别为谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸，按照0.2 %和1 %(V/W)2个不同浓度分别加入基本培养基MYA中。置于15℃人工气候箱培养2个月后，获取菌丝团。

按照RNeasy Plant Mini Kit(Qiangen)的说明书提取不同培养基上的长松萝地衣型真菌总RNA，用1.2 %的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，将RNA保存于-80℃冰箱。cDNA合成参照Prime Script 1stStand cDNA Synthesis的说明书操作，并将cDNA保存在-20℃冰箱。以特异引物(表1)检测非核糖体多肽合成酶UsNRPS基因的表达情况。

2结果与分析

2.1　基因片段的同源克隆

用简并引物Fnrps和RnrpsL2，以地衣型真菌的基因组DNA为模板，获得保守区域片段，回收纯化后连接到克隆载体pEASY-T3上，选择阳性克隆进行测序。对测序结果进行分析后，发现其中有一个约720 bp的克隆片段含有NRPS结构基因片段。根据这一片段设计特异引物(NRPS-FSP1、NRPS-FSP2、NRPS-FSP3、NRPS-RSP1、NRPS-RSP2、NRPS-RSP3，序列见表1)。将其经NCBI中的BLASTX比对，结果显示该片段的编码产物与Eutypalata的NRPS(GeneBank NO. xp 779494723.1) 的相应片段具60 %的相似性。

注：Oi为OidiodendronmaiusZn NRPS(KIM98444);Pe为PestalotiopsisficiNRPS(XP007833606);Gl为GlarealozoyensisNRPS(XP008079965);Sp为SporothrixschenckiiNRPS(ERT01323);所有保守氨基酸残基用*标记，两个氨基酸的变化用.表示。

Fig.2Alignment ofUsnealongissimapredicted non-ribosomal peptidessynthetases(NRPS)

active sites with five closely fungal NRPS

2.2　UsNRPS基因全长的获得

用Genome Walking Kit试剂盒，设计特异引物，以地衣型真菌DNA为模板，获得了UsNRPS基因。利用NCBI-ORF Finder上进行开放阅读框的的查找和翻译，得到了3个开放阅读框，全长3 057 bp，比对DNA和cDNA序列发现UsNRPS基因含有2个内含子(从起始密码子开始依次为1 522-1 568、1 830-1 895)和5'端、3'端的非编码区(图1)。3个外显子拼接总长1 686 bp，编码氨基酸残基561个。通过BLAST比对发现，该基因有1个功能结构域，即腺苷酰化结构域(AFD Class Ⅰ超酶家族)其保守活性位点为HSSGSTG-PKP-FH-YGSTE(图2)，其主要功能为识别、活化特定的氨基酸，并将其结合、传递到下一个结构域上，形成氨酰-AMP复合物。对UsNRPS基因的5'和3'端的非编码区进行BLAST比对，未发现与其同源的蛋白质序列。

河北的杂文刊物早年叫《杂文界》，只是一份在圈子内部交流的理论刊物，其主持者杜文远和楼沪光都是担任过《河北日报》副总编辑的老前辈，他们都曾经编发过我谈杂文创作的理论稿子，也转发过我的杂文（该刊不发原作）。后来，该刊改为《杂文月刊》，以发作品为主，我与其几任主编都保持着联系，几乎是“有求必应”。作为一个作者，得到这样的支持是很幸运的。

2.3　UsNRPS的生物信息学分析

2.3.1UsNRPS的理化性质分析

用在线软件ProtParam预测UsNRPS蛋白氨基酸残基序列的理化性质，相对分子质量为62 656.7，结构式C2820H4399N755O821S20，等电点6.00，半衰期20 h，脂肪系数85.26，不稳定系数40.56。不稳定系数在40以上为不稳定蛋白[26]，可能是过渡蛋白，性质不稳定。SignalP分析结果显示，UsNRPSs不存在信号肽，是一种非分泌蛋白，直接在细胞质合成。采用Target P软件预测其亚细胞定位，结果表明其蛋白位于细胞质基质中。

2.3.2分子系统进化分析

用MEGA对UsNRPS和其他11条同源蛋白序列进行Cluster比对，利用邻位连接法绘制系统进化树。结果(图3)显示，长松萝的NRPS蛋白与RasamsoniaemersoniiAFD(KKA21664) 、TalaromycesmarneffeiAFD(XP 002143737) 、TalaromycesstipitatusAFD(XP 002477949)的蛋白聚为一类，与酰基CoA连接酶(ACS)和4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)的亲缘关系较远。4CL、ACS和腺苷酰化结构域(AFD)同属于酰苷酸合成酶超家族，它们通过不同的保守的腺苷酸结合基序界定，它们的功能与氨基酰-tRNA合成酶的功能相似，即识别、活化特定的氨基酸。

2.3.3UsNRPS蛋白质三维结构预测

利用在线软件Swiss-Model 获取蛋白质的同源建模结果，预测该蛋白质Phi(φ)和Psi(ψ)角的分布方式，利用RasMol预测UsNRPS蛋白质的三维结构，并用在线软件PROCHECK对建模结果进行分析。结果显示，在二级结构αβαβα结构的基础上形成了较为致密的球状结构(图4A)。PROCHECK分析同源建模的结果，氨基酸残基的φ、ψ角均位于区域核心，证明其空间结构较为稳定，符合其对应天然蛋白质的构象。

图4UsNRPS蛋白的三维结构模型(A)和拉氏构象图(B)

Fig.4The putative 3D structure(A) and Ramachandram of UsNRPS protein(B)

2.4　不同碳氮源对UsNRPS基因的诱导表达情况的检测

以微管蛋白(tublin)为参照，TNRPKSF、TNRPKSR作为特异引物检测UsNRPS基因的诱导表达情况。RT-PCR结果(图5)显示，NRPS基因在MYA基本培养基和添加了天冬氨酸的培养基上不表达，在添加了2 %肌醇、10 %甘露醇、2 %山梨醇、2 %葡萄糖、10 %葡萄糖、0.2 %谷氨酰胺、1 %甘氨酸、0.2 %丙氨酸上有微弱表达。在添加了浓度为10 %肌醇、2 %甘露醇、10 %山梨醇、1 %谷氨酰胺、0.2 %甘氨酸的MYA培养基上表达强烈。在含2 %、10 %蔗糖和果糖的MYA培养基上均能诱导NRPS基因的强烈表达，但在含浓度为2 %、10 %葡萄糖的MYA培养基都只有微弱的表达。

图5UsNRPS在添加不同碳氮源的MYA培养基上的诱导表达情况

注：CK为MYA基本培养基;A为添加不同碳源；Ino为肌醇;Man为甘露醇;Sor为山梨醇;Sur为蔗糖;Glu为葡萄糖;

Fru为果糖;2,10分别代表2 %,10 %;B为添加不同氮源；Gmi为谷氨酰胺;Asp为天冬氨酸;Gly为甘氨酸; Ala为丙氨酸; 0.2,1代表0.2 %,1 %。

Fig.5Gene inducible expression ofUsNRPSwith different carbon source and amino acid

3讨论

长松萝是一种松萝科(Usneaceae)松萝属(Usnea)的地衣型植物，主要生于北半球原始森林的冷杉(Abiesfabri)、云杉(Piceaasperata)及松科(Pinaceae)植物上，因长松萝具清热解毒、止咳化痰、消炎等功效而被广泛当做民族药材使用[27]。长松萝中含有许多抗癌、消炎及抗菌的化合物，如长松萝的地衣丝状体中含巴尔巴地衣酸、松萝酸、地弗地衣酸、地衣聚糖、长松萝多糖、扁枝衣酸乙酯等[28～29]，还含有具药用价值的多肽类次生代谢产物。长松萝中有地衣型真菌和非地衣型内生真菌，因此本研究采取藻菌分离技术获取长松萝的地衣型真菌，并以长松萝地衣型真菌为研究对象研究长松萝中NRPS的诱导合成。

本研究利用同源克隆获得NRPS基因片段，根据此片段设计特异引物，以地衣型真菌DNA为模板，采用Gene walking的方法克隆得到UsNRPS基因的A结构域全长。结合BLAST比对和结构域分析显示，NRPS的A结构域能独立地行使其功能，是一个具独立活性的酶。利用同源序列构建系统进化树，UsNRPS蛋白和RasamsoniaemersoniiAFD(KKA21664)、TalaromycesmarneffeiAFD(XP 002143737)、TalaromycesstipitatusAFD(XP 002477949)蛋白聚为一类，与结构域分析相一致，其主要功能为识别、活化特定的氨基酸，即与特定的氨基酸结合形成氨酰-AMP复合物。NRPS的A结构域的特异性是由其中部的约200个氨基酸残基组成核心基序决定的，结合Torsten等的研究[30]，本研究中长松萝NRPS A结构域的保守活性位点HSSGSTG-PKP-FH-YGSTE可能是特性识别某些非极性氨基酸。生物信息学分析结果显示，UsNRPS不存在信号肽，定位于细胞质基质中，是一种性状不稳定的中间产物合成酶，可能参与形成NRPS；其蛋白质三维结构同Eutypalata的NRPS三维结构基本一致，均是在αβαβα二级结构的基础上形成了致密的蛋白质三维立体结构[31]。

渗透压和不同碳氮源添加物影响地衣型真菌的次生代谢产物和诱导产物的合成[32]。利用RT-PCR检测添加了不同碳氮源的MYA培养基上的UsNRPS基因的表达情况，实验结果显示，在MYA基本培养基上UsNRPS基因不会表达，但在添加了不同碳氮源的培养基上，会不同程度地部分诱导表达，蔗糖和果糖会强烈地诱导UsNRPS基因的表达。不同的碳氮源能够影响地衣型真菌产物次生代谢产物的产生，王毅等[25]在研究长松萝聚酮合酶的过程中，发现10 %的山梨醇和蔗糖(2 %和10 %)能够强烈地诱导UlPKS基因的表达。许灵波等[33]也发现不同的碳氮源对银杏(Ginkgobiloba)内生真菌能够明显地促进次生代谢产物的合成。NRPS的A结构域识别特定的底物并将其活化成氨酰基腺苷酸[34]。不同的A结构域识别不同的氨基酸，结合本研究中A结构域的诱导表达情况，天冬氨酸的极性最高，不能诱导A结构域的表达，可能不是其底物；而相对应的谷氨酰胺和丙氨酸的极性较低，能够随着浓度的增加而提高诱导的效率；而甘氨酸是一种不带电荷的极性氨基酸，极性程度较低，能够在较低浓度的情况下诱导A结构域的表达，随着浓度的增加其诱导表达效率会相应地降低；本研究所克隆的UsNRPS的A结构域可识别谷氨酰胺(Gmi)和丙氨酸(Ala)，对较低浓度的甘氨酸(Gly)具有较高的敏感度。在地衣型真菌中，非核糖体肽在长松萝中为首次发现，结合其诱导表达情况，可能是在长松萝生长过程中，合成并能够促进其地衣体生长的次生代谢物，仅在地衣体生长旺盛时诱导表达。本实验从长松萝地衣型真菌中首次克隆到了NRPS基因的A结构域的全长，并检测其在不同碳氮源的培养基中的表达情况，为利用工程菌发酵获得非核糖体肽类物质奠定基础，提供必要材料。

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The Genetic Clone and Identification of Non-ribosomal Peptides
Synthetases(NRPS)from Usnea longissima

YUAN Xiao-long1,2,CHEN Jian1,2,ZHANG Chuan-guang3,BI Wei1,2,WANG Juan1,2,WANG Yi1,2

(1.Yunnan Academy of Forestry, Kunming Yunnan 650201, P.R.China;2.Key Laboratory for Conservation of Rare,Endangered & Endemic Forest

Plants,State Forestry Administration,Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants,Kunming Yunnan 650201,

P.R.China;3.College of Resource and Environment, Yunnan Agricultural University,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

Abstract:TakingUsnealongissimalichen forming fungi as the materials, the segment and full length ofNRPSwere cloned by homology-based cloning and gene walking approaches,and relevant analysis on its bioinformatics,molecular phylogeny evolution and genetic inducible expression were also conducted.For the lichen fungi, the non-ribosomal peptide was first reported inUsnealongissimi, and the BLAST comparison shows that it is at A(adenylation)structure domain of theNRPSsgene.The bioinformatics analysis showsNRPSis a kind of secreted protein, which located in cytoplasmic matrix.The A domain proteins ofNRPSgene of bothUsNRPSandRasamsoniaemersoniiwere clustered.The RT-PCR analysis reveals that 2 % inositol,10 % mannitol,2 % sorbitol,2 % glucose,10 % glucose,0.2 % glutamine,1 % glacine,0.2 % alanine could induce the expression ofNRPSslightly,2 %,10 % sucrose and fructose could lure the expression ofNRPSheavily,while 0.2 %,1 % asparagines could suppress the expression ofNRPS.

Key words:Usnealongissimi;NRPS;gene clone;bioinformatics analysis;molecular phylogeny evolution;inducible expression

中图分类号：R 284;R 285

文献标识码：A

文章编号：1672-8246(2016)01-0014-08

*收稿日期：2015-06-30

基金项目：国家自然科学青年科学基金项目(31400488)，云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目(2010CI016)。

第一作者简介：原晓龙(1986-)，男，研究实习员，硕士，主要从事林木分子生物学研究。E-mail:xiaolony@126.com

通讯作者简介：王毅(1981-)，男，博士，助理研究员，主要从事植物学和分子生物学研究。E-mail:22825818@qq.com