覃杏幸 莫永华 刘桂玉

(1 广西科技大学第一附属医院妇产科，柳州市 545000，E-mail：guangxqinxx@tom.com；2 广西科技大学附属柳州市人民医院神经内科，柳州市 545000)

论著·临床研究

多柔比星联合顺铂化疗对宫颈癌放疗患者的疗效及对相关基因蛋白表达的影响

覃杏幸1莫永华2刘桂玉1

(1 广西科技大学第一附属医院妇产科，柳州市 545000，E-mail：guangxqinxx@tom.com；2 广西科技大学附属柳州市人民医院神经内科，柳州市 545000)

目的 探讨多柔比星联合顺铂化疗对宫颈癌放疗患者的疗效及对相关基因蛋白表达的影响。方法 选取60例宫颈癌患者，按照随机数表法分为观察组和对照组，每组30例。两组患者均给予放疗治疗，对照组加用顺铂化疗，观察组加用多柔比星联合顺铂化疗。观察两组患者治疗前后HeLa细胞脆性组氨酸三联体(FHIT)蛋白、淋巴细胞瘤-2相关X(Bax)蛋白、Ki-67蛋白的表达情况，比较两组的临床疗效、生存率、不良反应发生率。结果 治疗后，两组HeLa细胞FHIT、Bax蛋白表达均增高，观察组的表达水平均高于对照组(P<0.05)；治疗后，两组HeLa细胞Ki-67蛋白表达均降低，但观察组的表达水平低于对照组(P<0.05)。观察组与对照组的总有效率分别为83.33%、60.00%，观察组临床疗效优于对照组(P<0.05)；观察组患者的3、5年生存率均高于对照组患者(P<0.05)。两组不良反应发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 多柔比星联合顺铂对宫颈癌患者有良好的治疗效果，有效增加HeLa细胞FHIT、Bax蛋白的表达，降低Ki-67蛋白的表达，提高患者生存率，且不增加患者的不良反应发生率，是一种安全有效的治疗手段。

宫颈癌；多柔比星；顺铂；疗效；脆性组氨酸三联体；淋巴细胞瘤-2相关X蛋白；Ki-67

宫颈癌是妇科肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌[1-2]。每年全世界大约有超过20万女性死于宫颈癌，发病率呈现上升趋势，并呈现年轻化发病趋势，严重威胁妇女健康[3]。近年来随着研究的深入发展，人们认识到有效诱导细胞凋亡对肿瘤治疗有良好效果。HeLa 细胞为人宫颈癌的传代细胞，在宫颈癌的发生发展过程中极为重要。有研究发现HeLa细胞的变异与其细胞内脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad，FHIT)蛋白、B淋巴细胞瘤-2相关X(B-cell lymphoma-2 associated X，Bax)蛋白、Ki-67蛋白表达改变有极大关系[4]。因此本研究通过观察多柔比星联合顺铂化疗对宫颈癌患者疗效及对基因蛋白表达的影响，以期探讨HeLa细胞在宫颈癌治疗中的重要作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2008年12月至2010年12月广西科技大学第一附属医院妇产科收治的60例宫颈癌患者。整个研究均在患者及其家属知情同意下完成，并获得我院伦理委员会批准。纳入标准：(1)经病理活检证实为宫颈癌；(2)经组织学证实为鳞癌且其临床分期为Ⅱa期～Ⅲb期；(3)无心、肝、肾等重要器官损害、无出血性疾病等，一般状况良好；(4)既往无癌症病史，且该次患病前无放化疗史。排除标准：(1)一般状况差、不能耐受化疗者；(2)存在明显的恶病质、或远处转移者；(3)具有化疗禁忌证者。按照随机数表法将60例患者分为观察组和对照组，每组30例。对照组年龄为32.4～63.3岁，观察组年龄为31.1～64.9岁。两组患者在年龄、肿瘤直径、分期等临床资料方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 治疗方法 (1)化疗：对照组在放疗同时给予顺铂(齐鲁制药有限公司；生产批号：20081009；30 mg/支)40 mg/m2，静脉滴注，1次/周，于放疗的间歇进行，共进行6个周期的化疗。观察组在对照组基础上给予多柔比星(浙江海正药业股份有限公司；生产批号：20081111；5 ml：10 mg)30 mg/m2，静脉滴注，1次/周，于放疗的间歇进行，共进行6个周期的化疗。(2)放疗：放疗采用15MV X线外放射与192Ir高剂量率腔内后装联合。外放射方法：先对全盆腔进行放疗，剂量为1.8～2.2 Gy/次，1次/d，每周5次，宫旁总剂量为25～30 Gy。全盆腔的放疗完成后，再进行盆腔的四野外放射，剂量为1.8～2.0 Gy/次，1次/d，每周进行4次，到宫旁总剂量为15～20 Gy。于盆腔四野外进行放射的同时进行192Ir高剂量率腔内后装的治疗，1次/周。宫腔、阴道的治疗依次进行，A点每次剂量为6 Gy，总剂量为36～42 Gy。在放疗期间每天进行阴道冲洗。每周复查血常规，定期复查肝肾功能，必要时给予升白细胞、保肝、止吐、护肾等对症处理。

1.3 观察指标 观察两组患者治疗前后HeLa细胞FHIT、Bax、Ki-67蛋白表达、临床疗效、1、3、5年生存率、不良反应(恶心呕吐、血红蛋白下降、白细胞下降、心脏毒性、肺毒性、肝毒性)的发生情况。近期疗效的评价根据世界卫生组织对于实体瘤的疗效评价标准[5]，将其分为完全缓解(complete remission，CR)、部分缓解(partial remission，PR)、疾病稳定(stable disease，SD)和疾病进展(progressive disease，PD)，其中完全缓解+部分缓解总和为有效。在同步放化疗完成3个月时进行复查，并对其进行疗效评定。对所有患者进行随访，评价1年、3年、5年生存率。

1.4 FHIT、Bax、Ki-67蛋白表达的检测

1.4.1 药物与试剂：采用1 mg/ml的生理盐水将顺铂(购于山东德州制药厂)配成储存液。噻唑蓝购自华美公司(批号20080102)。FHIT、Bax、Ki-67抗体及试剂盒购自北京中杉生物科技有限公司( 批号20080203)。

1.4.2 细胞爬片免疫组织化学实验：分别于治疗前及治疗后6周，检测患者FHIT、Bax、Ki-67蛋白表达：子宫颈癌HeLa细胞检测的标本从所取活检组织中提取：使用扩阴器扩开阴道后，使用组织钳钳取组织，在胰酶消化后计数，调整细胞密度为 3×104/ml，置于含10%胎牛血清、100 U/ml含青霉素、100 μg/ml链霉素的1640培养基在含5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化传代。后将其置于六孔板内放盖玻片，将经胰酶消化后的HeLa细胞以3×104/ml浓度均匀滴于盖玻片上，待细胞贴壁后加培养液2 ml培养24 h，取出盖玻片，磷酸缓冲盐溶液洗涤后，用 10%多聚甲醛固定，-4℃过夜。蒸馏水冲洗，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶联结免疫组织化学法对标本进行处理，在进行免疫组化后检测相应的浓度。

1.5 统计学分析 应用SPSS 11.5软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，采用t检验，计数资料比较采取χ2检验，等级资料比较采用秩和检验，生存率的计算采用生存分析Kaplan-Meier法，生存率的比较采用Log-Rank χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 治疗前后两组患者的HeLa细胞FHIT、Bax、Ki-67蛋白表达比较 治疗后，观察组与对照组FHIT、Bax表达均增高(P<0.05)，且观察组的表达均高于对照组(P<0.05)；治疗后，观察组与对照组Ki-67表达均减少(P<0.05)，且观察组的表达低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 治疗前后两组患者HeLa细胞的FHIT、Bax、Ki-67蛋白表达比较(x±s，μg/ml)

2.2 两组患者临床疗效的比较 观察组的临床疗效优于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组患者临床疗效的比较(n，%)

2.3 两组患者生存率的比较 观察组患者的3年及5年生存率高于对照组患者(P<0.05)。见表4及图1。

表4 两组患者生存率的比较(%)

图1 两组生存曲线

2.4 两组患者的不良反应比较 观察组与对照组的不良反应发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 两组患者的不良反应比较(n，%)

3 讨 论

研究表明，无论对宫颈癌患者施行手术治疗还是进行放射治疗，均可以取得较好临床治疗疗效[6]。在20世纪80年代之前，学术界普遍认为宫颈癌对化疗不敏感，只有在其他的治疗措施均失败以后才考虑进行化疗。1983年，Friedlander等[7]首次报告宫颈癌患者使用化疗治疗。随后有许多研究也表明宫颈癌对化疗敏感[8-9]。目前，宫颈癌的化疗方案众多，但是大多数化疗方案的治疗效果有限，且不良反应较严重，大多数患者不能耐受。此外，有的化疗药物因存在剂量限制性，受到极大限制。

近年来，抗癌药物的发展日新月异，宫颈癌的各种化疗方案层出不穷。目前宫颈癌的最佳化疗方案仍没有得到普遍统一，目前常用化疗方案主要以铂类为基础药物的化疗，如BIP(博来霉素+异环磷酰胺+顺铂)、PVB(顺铂+长春新碱+博来霉素)等方案。但由于这些方案药物不良反应均很大，其临床应用受到极大限制[10-11]。同步放化疗(concurrent chemoradiotherapy，CCRT)目前已被美国的国家癌症研究所推荐作为宫颈癌的治疗标准，并作为Ⅰb2期以上的宫颈癌的标准治疗模式。美国国立综合癌症网络在治疗指南推荐顺铂作为CCRT 1类证据治疗宫颈癌[12]。但是顺铂的胃肠反应以及肾脏毒性大[13]。多柔比星既为抗生素，也可以有效抑制肿瘤细胞的DNA、RNA合成，为周期非特异性的抗肿瘤药物，其对不同生长周期的肿瘤细胞均有杀伤作用。有研究显示多柔比星与顺铂、氟脲苷等药物联合使用具有有协同作用[14]。

HeLa细胞为人宫颈癌的传代细胞，在宫颈癌的发生发展过程中极为重要。有研究发现HeLa细胞的变异与其细胞内FHIT、Bax、Ki-67蛋白表达改变有极大关系。FHIT基因定位在3p14.2内，为宫颈癌等位基因的缺失发生高发区，其表达减少和缺失被认为与人体多种恶性肿瘤的产生发展密切相关。有研究结果表明，从正常宫颈到浸润性宫颈癌，伴随着疾病进展，FHIT的表达会逐渐减少[13]。Bax基因为淋巴细胞瘤-2凋亡家族中重要成员，其表达增高可以有效诱导肿瘤细胞的凋亡。近年来研究表明Ki-67抗原可以作为衡量肿瘤细胞增生程度的指标[14]。Ki-67抗原主要表达在增殖期细胞核抗原当中，也存在于核仁中，其参与调控细胞周期，它对细胞的增殖十分重要[15]。

本研究观察多柔比星联合顺铂对宫颈癌患者治疗疗效及对基因表达的影响，结果显示，治疗后两组的HeLa细胞FHIT、Bax蛋白均表达增高、Ki-67蛋白表达降低(P<0.05)，且观察组的FHIT、Bax蛋白表达均高于对照组(P<0.05)，Ki-67蛋白的表达低于对照组(P<0.05)，提示宫颈癌细胞的增殖受到抑制后FHIT、Bax蛋白的表达上调，而Ki-67蛋白表达下调，且多柔比星联合顺铂化疗的效果更为明显。从疗效来看，多柔比星联合顺铂患者的总有效率为83.33%，其3、5年生存率分别为93.33%、83.33%，均高于单用顺铂化疗患者(P<0.05)，且两组的不良反应发生率无明显差异(P>0.05)，这提示多柔比星联合顺铂能够取得较好临床治疗效果的同时，并不会增加药物的副作用。

综上所述，多柔比星联合顺铂对宫颈癌患者有良好的治疗效果，有效增加HeLa细胞FHIT、Bax的表达，降低Ki-67的表达，能够提高患者的生存率，且不增加患者的不良反应发生率，是一种安全有效的治疗手段。

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Effect of chemotherapy with doxorubicin combined with cisplatin on efficacy and protein expressions of related genes in cervical cancer patients undergoing radiotherapy

QINXing-xing1,MOYong-hua2,LIUGui-yu1

(1DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou545000,China;2DepartmentofNeurology,LiuzhouPeople′sHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou545000,China)

Objective To explore the effect of chemotherapy with doxorubicin combined with cisplatin on efficacy and protein expressions of related genes in cervical cancer patients undergoing radiotherapy.Methods Sixty patients with cervical cancer were divided into observation group and control group using the random number table,with 30 cases in each group.Both groups were treated with radiotherapy.Additionally,the control group received chemotherapy with cisplatin,and the observation group received chemotherapy with cisplatin and doxorubicin.The fragile histidine triad(FHIT) protein,B-cell lymphoma-2 associated X(Bax) protein and Ki-67 protein expressions of HeLa cells before and after treatment were observed in both groups.The clinical efficacy,survival rate and incidence rate of adverse effects were compared between the two groups.Results After treatment,FHIT protein and Bax protein expressions of HeLa cells increased in both groups,but the expression levels in the observation group were higher than those in the control group(P<0.05).After treatment,Ki-67 protein expression of HeLa cells in both groups decreased,but the expression level in the observation group was lower than that in the control group(P<0.05).The total effective rates of the observation group and control group were 83.33% and 60.00% respectively,and the clinical efficacy of the observation group was superior to that of the control group(P<0.05).The three-year and five-year survival rates in the observation group were higher than those in the control group(P<0.05).There was no significant difference in the incidence rate of adverse reactions between the two groups(P>0.05).Conclusion Doxorubicin combined with cisplatin obtains a good efficacy for the treatment of cervical cancer,and can effectively increase the expressions of FHIT and Bax proteins and reduce the expression of Ki-67 protein in the HeLa cells.Moreover,it can improve the survival rate of patients and does not increase the incidence rate of adverse reactions,so it is a safe and effective therapeutic approach. 【Key words】 Cervical cancer,Doxorubicin,Cisplatin,Efficacy,Fragile histidine triad,Lymphocyte tumor-2 associated X protein,Ki-67

覃杏幸(1977～)，女，硕士，主治医师，研究方向：妇科肿瘤疾病研究。

R 737.33

A

0253-4304(2016)09-1256-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.19

2016-04-01

2016-07-03)