孙朝文 张广钰 赵 辰 成怀福 钟 漓 戴 凌

(1 桂林医学院附属医院胃肠外科，桂林市 541001；2 桂林医学院研究生学院，桂林市 541004，E-mail：sunchaowen20081010@163.com)

论著·基础研究

凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠T淋巴细胞增殖及活性的影响▲

孙朝文1，2张广钰1赵 辰1，2成怀福1，2钟 漓1戴 凌1

(1 桂林医学院附属医院胃肠外科，桂林市 541001；2 桂林医学院研究生学院，桂林市 541004，E-mail：sunchaowen20081010@163.com)

目的 探讨凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠T淋巴细胞增殖及活性的影响。方法 (1)取对数生长期大肠癌CT26细胞制备凋亡肿瘤细胞及坏死肿瘤细胞，取Balb/c小鼠脾脏分离T淋巴细胞，并制备细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。(2)将凋亡肿瘤细胞、坏死肿瘤细胞、正常肿瘤细胞分别与小鼠CTL共同培养(分别为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组)，测定CTL的活性及增殖情况。(3)将小鼠T淋巴细胞分为对照组、刀豆蛋白A(ConA)组、凋亡肿瘤细胞+ConA组、坏死肿瘤细胞+ConA组、活肿瘤细胞+ConA组，经相应处理后测定各组T淋巴细胞的活性及增殖情况。(4)选取30只Balb/c小鼠分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组各10只，分别将凋亡、坏死、对数生长期CT26细胞通过皮下及静脉输注小鼠，检测各组小鼠血清调节性T细胞(Treg)的表达情况。(5)另取30只小鼠，按方法(4)分组及处理后，测定各组小鼠血清可溶性Fas(sFas)、白细胞介素(IL)-12、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-4、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平。结果 凋亡肿瘤细胞组中CTL的活性、A450值均低于其他两组(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞+ConA组的T淋巴细胞CD69、CD25、CD71的表达率以及G2、G3及G4期的T淋巴细胞数量均低于ConA组、活肿瘤细胞+ConA及坏死肿瘤细胞+ConA(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞组Treg的表达水平、sFas相对表达量低于肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞组IL-10、TGF-β表达水平高于其他两组(P<0.05)，而 IL-12表达水平均低于其他两组(P<0.05)，IL-4表达水平则高于肿瘤细胞对照组(P<0.05)。结论 凋亡小鼠大肠癌CT26细胞能够抑制小鼠T淋巴细胞增殖及活性，影响大肠癌小鼠正常免疫功能。

大肠癌；CT26细胞；T淋巴细胞；活性；增殖；调节性T细胞；可溶性Fas；小鼠

大肠癌又称为结直肠癌，是最为常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率位居全球恶性肿瘤第3位[1]，近年来我国大肠癌的发病率持续上升，现已分别位居男性恶性肿瘤发病第5位和女性恶性肿瘤发病第3位。近年来，虽然在大肠癌治疗方面取得巨大进步，然而大肠癌仍是全球癌症死因的主要原因之一[2]。目前认为大肠癌发生的主要原因是遗传因素和环境因素[3]，大肠癌患者机体的免疫功能改变主要包括调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)数量增高、肿瘤应答的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T cell，CTL)活性降低及对肿瘤细胞的免疫耐受，机体免疫监视功能的降低与丧失被认为是大肠癌发生的主要表现。近年来，负载肿瘤抗原的树突状细胞(dendritic cells，DC)疫苗被应用于治疗肿瘤，从理论上这一方法可以诱导特异性CTL、增强荷瘤机体的免疫功能，但迄今为止，机体对肿瘤的免疫耐受仍然是目前肿瘤免疫治疗需要克服的主要障碍[4-7]。尽管肿瘤细胞表达了丰富的“自己”和“异己”抗原，可是表达的这些抗原并没有引起排斥肿瘤的免疫反应[8-9]。目前凋亡肿瘤细胞导致机体对肿瘤免疫耐受的机制也未明确，因此，本研究分析凋亡大肠癌CT26细胞诱导小鼠对T淋巴细胞增殖及活性的影响，以期为肿瘤免疫治疗、建立新的思维方法发展新的肿瘤治疗途径提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验药物 放线菌素D(美国Sigma公司，生产批号：1102C035)；6%可溶性淀粉肉汤：在100 ml肉汤培养基[北京海淀中海动物保健科技公司，090216(PT-1)]中加入可溶性淀粉6 g，经煮沸灭菌30 min，置4℃冰箱保存备用。

1.2 实验动物 清洁级6～8周龄Balb/c小鼠70只，雄性，体重(240±30)g，动物许可证号：SCXK(湘)2014-0015，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。所有小鼠均按无特定病原体级饲养，且所有实验均通过动物伦理委员会认证。

1.3 细胞株及主要试剂 小鼠结肠癌细胞株CT26，购于中国科学院细胞库。膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，FITC)细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司，生产批号：20140331)；胰酶(美国Gibco公司，生产批号：1220087)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美国Sigma公司，生产批号：141215)；刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A；美国Sigma公司，生产批号：11028-71-0)；荧光染料羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE；美国Molecular Probes公司，生产批号：11348)等；酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，生产批号：130422)等。

1.4 仪器 CO2培养箱(Thermo Forma公司，型号：311)，双人超净工作台(苏州净化设备有限公司，型号：BCM-1000)，倒置荧光显微镜(日本Olympus，型号：CKX-31)，离心机(德国Eppendorf，型号：Centrifuge 5415R)，移液枪(芬兰百得公司，型号：Genex，规格：20～200 μl)，BL-420生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司，型号：BL-420S)等。

1.5 方法

1.5.1 CT26细胞的培养及凋亡、坏死肿瘤细胞的制备：将CT26细胞用含10%胎牛血清(美国Gibco公司，生产批号：14000-044)的RPMI-1640培养基(美国Gibco公司，生产批号：120917)培养于5% CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。通过取对数生长期CT26细胞接种于6孔板中，调整密度为1×106细胞/孔。待细胞贴壁后加入含放线菌素D(200 ng/ml)的培养基培养12 h诱导凋亡，用胰酶消化，收集悬液并依次加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的碘化丙啶(propidium iodide，PI；美国Sigma公司，生产批号：20120811)，混匀后室温避光孵育15 min后使用流式细胞仪检测细胞凋亡，富集，按不同浓度稀释备用。另取对数生长期CT26细胞用加热法(肿瘤细胞株56℃水浴1 h)制备坏死肿瘤细胞，显微镜下观察细胞的坏死形态改变并确定，台盼蓝拒染法检测细胞死亡率，按不同浓度稀释(取0.5 ml台盼蓝溶液、0.3 ml Hanks或者PBS和0.2 ml细胞悬液，充分混匀，或者0.4%的台盼蓝与制好的细胞悬液等体积混合)，然后将混合液放置5～15 min备用。

1.5.2 T细胞亚群、CTL的制备及CTL分组：适应性喂养5～6 d后，取6～8周龄雄性Balb/c小鼠10只，适应性喂养5～6 d后再正常喂养3 d后，脱颈椎处死，取脾脏，去被膜，于200目不锈钢网过滤，800 r/min离心4 min，收集待分离细胞，将细胞悬浮于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)，采用免疫磁珠分选法分离T细胞亚群，通过流式细胞仪鉴定其表型，分选出的阳性细胞用荧光标记的相应抗体通过荧光激活细胞分离法鉴定纯度。将T淋巴细胞与凋亡肿瘤细胞按25 ∶1比例混匀，静置于培养箱中共培养，4 d后半量换液，继续培养3 d。第2周起，每周加比例为10 ∶1的凋亡细胞1次，共3次。其中在第2次的第3天加入白细胞介素(interleukin，IL)-2(终浓度20 U/ ml)，并每隔3～4 d更换1次培养基。在第2次结束后，1 500 r/min离心15 min，收集细胞，即特异性CTL，计数、调整至合适浓度。将小鼠CTL分别经相应肿瘤细胞处理后分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组3个亚组。(1)凋亡肿瘤细胞组：先将CTL与凋亡肿瘤细胞在96孔培养板内共孵育2 h，后以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)加入凋亡肿瘤细胞继续孵育至4 h。(2)坏死肿瘤细胞组：先将CTL与坏死肿瘤细胞在96孔培养板内共孵育2 h，后以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)加入坏死肿瘤细胞继续孵育至4 h。(3)肿瘤细胞对照组：CTL与正常肿瘤细胞以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)在96孔培养板内孵育至4 h。

1.5.3 免疫细胞活性检测：采用51 Cr 释放实验测定3组CTL免疫细胞活性，其中以相应肿瘤细胞为靶细胞并预先以Na251CrO4标记，CTL细胞为效应细胞。各组同时设自然释放对照孔及最大释放对照孔。分别取每组各孔上清，用γ计数仪测量放射活性值(单位：cpm)。根据下式计算51Cr自然释放率和CTL活性：

1.5.4 免疫细胞增殖检测：采用细胞计数(cell counting kit-8，CCK-8)法检测鼠的CTL淋巴细胞增殖情况。分别将凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组中的CTL与对数生长期的CT26细胞按25 ∶1比例混匀铺96孔板，细胞重悬成单细胞悬液，每孔1×103个细胞，100 μl培基，每组3个复孔，96孔板边上一圈的孔不铺细胞，只加PBS用于调零。将培养板静置于37℃，5% CO2培养箱内共培养72 h，终止培养前2 h加入每孔加入10 μl的CCK-8试剂(上海碧云天生物技术有限公司，生产批号：20120503)，继续将培养板在培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(A值)，计算细胞增殖活性。

1.5.5 流式细胞仪检测：(1)将小鼠T淋巴细胞不同亚群用CFDA-SE进行染色后，分为对照组、ConA组、凋亡肿瘤细胞+ConA组、坏死肿瘤细胞+ConA组、活肿瘤细胞+ConA组，其中凋亡肿瘤细胞+ConA组、坏死肿瘤细胞+ConA组、活肿瘤细胞+ConA组分别与凋亡、坏死、活肿瘤细胞共培养2 h，然后于ConA组、凋亡肿瘤细胞+ConA组、坏死肿瘤细胞+ConA组、活肿瘤细胞+ConA组培养基中加入Con A继续培养48 h后取出，流式细胞术检测不同周期T淋巴细胞的增殖情况。(2)将小鼠不同亚群T淋巴细胞分为对照组、ConA组、凋亡肿瘤细胞+ConA组、坏死肿瘤细胞+ConA组、活肿瘤细胞+ConA组，其中凋亡肿瘤细胞+ConA组、坏死肿瘤细胞+ConA组、活肿瘤细胞+ConA组分别与凋亡、坏死、活肿瘤细胞共培养2 h，然后于ConA组、凋亡肿瘤细胞+ConA组、坏死肿瘤细胞+ConA组、活肿瘤细胞+ConA组培养基中加入ConA继续培养36 h，分别于12 h和36 h取出，洗涤，去上清，加入相应标记单克隆抗体(CD69抗体、CD25抗体、CD71抗体)，用流式细胞仪检测各组T淋巴细胞活化标记分子CD69、CD25、CD71的表达。(3)选取6～8周龄雄性Balb/c小鼠30只，采用随机数字表法分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组各10只，通过皮下及静脉分别注射凋亡、坏死、对数生长期的CT26细胞，其中皮下注射采用1×107/ml密度、0.05 ml的注射量，静脉注射采用1～3 ml的注射量输注入小鼠。采用三色标记技术、流式细胞仪检测各组小鼠血清Treg表达情况。取小鼠外周静脉血4 ml以乙二胺四乙酸抗凝，充分混匀。取10 ml离心管，将4 ml全血缓慢加在4 ml淋巴细胞分离液上部，2 000 r/min室温离心20 min。轻轻吸取中间白色淋巴细胞层至另一管，2 000 r/min室温离心5 min，去上清。加2 ml PBS混匀，2 000 r/min室温离心5 min，去上清。计数细胞后调整细胞浓度至1×106/ml。取200 μl上述单细胞悬液，在对照管和实验管中分别加入100 μl，且在两管中均加入直接荧光标记的鼠抗人特异性单抗、直接荧光标记的鼠抗人特异性单抗各5 μl，4℃避光孵育30 min。加流式细胞术染色缓冲液，混匀。2 000 r/min室温离心5 min，去上清。对照管和实验管中各加入2 ml破膜剂。4℃避光孵育45～60 min。2 000 r/min，离心5 min，去上清。对照管和实验管中各加入2 ml通透缓冲液，2 000 r/min，室温离心5 min，去上清。重复通透缓冲液洗细胞步骤1次。对照管和实验管各加入100 μl通透缓冲液，充分混匀，再加正常大鼠血清2 μl，4℃避光孵育15 min。无需通透缓冲液清洗细胞，直接在对照管中加入免疫球蛋白G1-绿脓杆菌外毒素2.5 μl，实验管中加入Foxp3-绿脓杆菌外毒素20 μl。4℃避光孵育至少30 min。对照管和实验管中各加入2 ml通透缓冲液，2 000 r/min室温离心5 min。去上清，重复通透缓冲液清洗步骤一次。加400 μl通透缓冲液上机检测。

1.5.6 ELISA检测免疫因子表达水平：选取6～8周龄雄性Balb/c小鼠30只，采用随机数字表法分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组各10只，通过皮下及静脉分别注射凋亡、坏死、对数生长期的CT26细胞，其中皮下注射采用1×107/ml密度、0.05 ml的注射量，静脉注射采用1～3 ml的注射量输注入小鼠。经尾静脉采血约500 μl，待血自然凝固后，5 963 r/min离心10 min，吸取血清分装冻存于-70℃冰箱内，避免反复冻融。采用ELISA严格按照操作说明书进行检测血清可溶性Fas(soluble Fas，sFas)、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10、IL-12、转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)水平。测定标本A450值，以标准品浓度作横坐标，A值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，通过标本的A值可在标准曲线上查出其浓度。

1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0软件进行统计学处理。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验或q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同状态肿瘤细胞对小鼠体外CTL活性的影响 3组51Cr自然释放率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。凋亡肿瘤细胞组中CTL不同效靶比的CTL活性均低于其他两组(P<0.05)，见表1。

表1 不同状态肿瘤细胞对 小鼠体外CTL活性的影响(x±s，%)

注：与坏死肿瘤细胞组比较， △P<0.05；与肿瘤细胞对照组比较，#P<0.05。

2.2 不同状态肿瘤细胞对小鼠体外CTL增殖的影响 凋亡肿瘤细胞组CTL的A450值低于其他两组(P<0.05)，见表2。

表2 不同状态肿瘤细胞 对小鼠体外CTL增殖的影响(x±s)

注：与坏死肿瘤细胞组比较，△P<0.05；与肿瘤细胞对照组比较，#P<0.05。

2.3 不同状态肿瘤细胞对ConA诱导的小鼠体外T淋巴细胞活化的影响 凋亡肿瘤细胞+ConA组T淋巴细胞CD69、CD25、CD71的表达率低于ConA组、活肿瘤细胞+ConA及坏死肿瘤细胞+ConA(P<0.05)，高于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 不同状态肿瘤细胞对 ConA诱导T细胞体外活化表达率的影响(x±s，%)

注：与凋亡肿瘤细胞+ConA组比较，*P<0.05。

2.4 不同状态肿瘤细胞对ConA诱导的小鼠体外T淋巴细胞增殖的影响 CFDA-SE染色后可见凋亡肿瘤细胞组G2、G3及G4期的T淋巴细胞数量均低于ConA组、活肿瘤细胞+ConA及坏死肿瘤细胞+ConA(P<0.05)，3组增殖指数(proliferation index，PI)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同状态肿瘤细胞对ConA诱导的T细胞增殖影响(x±s，%)

注：与凋亡肿瘤细胞+ConA组比较，*P<0.05。

2.5 不同状态肿瘤细胞对小鼠Treg表达的影响 凋亡肿瘤细胞组的Treg的表达低于肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组(P<0.05)，见表5。

表5 不同状态肿瘤细胞对小鼠Treg表达的影响(x±s，%)

注：与凋亡肿瘤细胞比较，*P<0.05。

2.6 不同状态肿瘤细胞对对小鼠血清sFas、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平的影响 凋亡肿瘤细胞组sFas相对表达量低于坏死肿瘤细胞组和正常肿瘤细胞细胞(P<0.05)，而坏死肿瘤组sFas相对表达量则高于肿瘤细胞对照组(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞组抗炎因子IL-10、TGF-β表达水平高于肿瘤细胞对照组与坏死肿瘤细胞组(P<0.05)，IL-4表达水平则高于肿瘤细胞对照组而低于坏死肿瘤细胞组(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞组促炎因子IL-12表达水平均低于正常肿瘤细胞与坏死肿瘤细胞(P<0.05)。见表6。

表6 ELISA法检测不同状态肿瘤细胞对小鼠血清sFas、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平的影响(x±s)

注：△指与坏死肿瘤细胞组比较，P<0.05；#指与凋亡肿瘤细胞组比较，P<0.05。

3 讨 论

Kerr于1972年首次提出，细胞凋亡是一种细胞正常生理现象下发生的程序性死亡，能将无功能细胞进行非炎症性清除，对于机体发挥免疫功能具有极其重要的作用[10]。机体通过凋亡的形式阻止免疫应答的发生，而免疫细胞通过吞噬凋亡细胞从而加强或抑制机体的免疫应答[11]。在细胞凋亡的早期阶段，凋亡细胞释放“find-me”信号以被吞噬细胞识别[12]，从而吸引这些吞噬细胞接近凋亡细胞。接着凋亡细胞胞膜结构发生变化，表达“find-me”信号[13]，如磷脂酰丝氨酸的反转表达[14]等，引起周围组织中具有吞噬作用的细胞迅速识别并对其进行吞噬，凋亡细胞被接触和(或)吞噬后，吞噬细胞内发生一系列特殊的变化，引起一些炎性因子的表达降低，如粒细胞集落刺激生物因子[15]、肿瘤坏死因子-α、IL-4等，而前列腺素E2、血小板活性化因子等抗炎因子表达和分泌水平提高，使吞噬细胞表达抗炎表型，发挥抑制炎性反应的作用。Liu等[16]认为凋亡细胞被专职的吞噬细胞识别而激发抗炎反应，下调炎症因子水平。细胞凋亡参与免疫系统的调节，诱导机体发生免疫耐受。有研究表明，细胞凋亡能保持机体免疫系统的平衡和稳定，发挥免疫调节的作用[17]。陈建锋等[18]认为，细胞凋亡可能抑制机体局部的炎症反应，诱导免疫耐受。本次实验旨在通过用多种实验方法来验证凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠体外T淋巴细胞及其活性的抑制作用。

51Cr释放实验结果显示， 凋亡肿瘤细胞组中CTL的51Cr自然释放率、不同效靶比的CTL活性均低于坏死肿瘤细胞组及肿瘤细胞对照组(P<0.05)，提示凋亡大肠癌CT26细胞培养的免疫细胞活性受到抑制。而用CCK-8检测结果显示，凋亡肿瘤细胞组CTL的A450值也低于其他两组(P<0.05)，提示凋亡大肠癌CT26细胞能够抑制小鼠的CD8+T淋巴细胞增殖。ConA具有强力的促有丝分裂、促淋巴细胞转化反应的作用，能选择性激活被抑制的T淋巴细胞。由于ConA是T淋巴细胞分裂原，本实验采用ConA进行诱导干预作用，在细胞培养时加入ConA能够促进细胞活化增殖，诱导细胞分裂，进而观察不同状态肿瘤细胞对ConA诱导的小鼠体外T淋巴细胞活性及增殖的影响，判断细胞免疫的功能状态，结果显示，凋亡肿瘤细胞+ConA组T淋巴细胞CD69、CD25、CD71的表达率以及G2、G3及G4期的T淋巴细胞数量仍均低于ConA组、活肿瘤细胞+ConA及坏死肿瘤细胞+ConA(P<0.05)。

ELISA检测显示凋亡肿瘤细胞组CT26细胞的sFas相对表达量明显低于坏死肿瘤细胞组和肿瘤细胞对照组(P<0.05)，其亦对小鼠血清IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β表达水平产生影响，其中与正常肿瘤细胞组与坏死肿瘤细胞组比较，凋亡肿瘤细胞组抗炎因子IL-10、TGF-β表达水平升高，促炎因子IL-12表达水平降低(P<0.05)，IFN-γ水平也降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，此外抗炎因子IL-4表达水平也高于肿瘤细胞对照组(P<0.05)。提示凋亡中或者即将启动凋亡的肿瘤细胞中sFas及相关免疫抗炎因子表达水平上升，促炎因子下降，这也从另一角度反映炎症反应得到了抑制。Sakaguchi等[19]研究发现Treg在局部造成的免疫抑制微环境是帮助肿瘤细胞逃避免疫杀伤的关键。因此CD8+T和IFN-γ也是反映Treg免疫抑制状态的重要间接指标。本研究中，IFN-γ水平变化不甚明显的原因可能是实验误差、未多次重复实验等。Fas配体能够抑制细胞凋亡，但在已经发生凋亡的肿瘤细胞中却能发挥抑制T淋巴细胞的活性甚至低效诱导T淋巴细胞凋亡。在此基础上其可能同时诱导中性粒细胞趋化，进而导致机体出现免疫耐受。

此外，本实验也进行了流式细胞仪检测不同状态肿瘤细胞对小鼠Treg表达情况，结果显示凋亡肿瘤细胞组Tregs的表达均较坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组明显减弱(P<0.05)，这提示在活体小鼠体内凋亡的CT26细胞可抑制小鼠免疫系统的Treg表达。目前，对于Treg诱导的免疫抑制状态与CT26模型小鼠肿瘤的影响作用有许多新的观点。Tanaka等[20]研究认为，已凋亡细胞提供了丰富的抗原从而使机体建立起外周免疫耐受，而King等[21]认为肿瘤细胞会抑制细胞凋亡特别是对肿瘤细胞自身的凋亡刺激，两者的结论有本质区别。DC通过吞噬负载抗原的凋亡细胞而诱导免疫耐受，未成熟的DC细胞能递呈凋亡信号至抗原特异性T细胞，从而抑制T细胞的增殖，这表明在体内凋亡的诱导能导致抗原特异性耐受，很有可能通过DC和Treg介导[22]。凋亡细胞导致免疫耐受，这在大鼠心脏移植、C57/B1/6小鼠脾分离及与小鼠脾源性淋巴细胞共培养等实验中得到证实[23-26]。而我们的研究结果也提示凋亡的凋亡大肠癌CT26细胞无论在体外还是在活体小鼠体内都可抑制T淋巴细胞的增殖和活性。当机体固有免疫系统功能受到抑制时，炎性因子的活性受到影响，可能成为诱导机体对肿瘤细胞产生免疫耐受的重要环节。

那么凋亡CT26细胞是通过增加了抗肿瘤的效应而对抗 Treg的免疫抑制亦或是抑制了Treg的功能而发挥了抗肿瘤效应呢？ Shi等[27]认为Treg通过分泌TGF-β和IL-10以抑制免疫反应，而Dash等[28]认为TGF-β影响Treg的转录和扩增，且IL-10与小鼠 Treg的数量和功能紧密相关。在本实验中，凋亡肿瘤细胞组Tregs降低，其血清中TGF-β和 IL-10 表达水平增高，提示凋亡CT26细胞抑制外周血中Treg分泌IL-10的能力，表明凋亡CT26细胞有抑制Treg免疫调节的作用，而阮志燕等[29]认为大黄素能抑制CT26结肠癌小鼠Treg的生物学功能，其通过影响Treg的免疫抑制功能而发挥抗肿瘤作用，这与我们的结论有相似之处。

综上所述，凋亡小鼠大肠癌CT26细胞能够抑制小鼠T淋巴细胞增殖及其活性表达，影响大肠癌小鼠正常免疫功能。尽管目前对与凋亡CT26细胞的作用靶点尚不清楚， 但是其对 Treg的抑制作用在本实验中得到进一步证实。因此，我们认为凋亡的大肠癌CT26细胞也能像正常细胞一样抑制机体免疫调节，抑制T淋巴细胞的增殖和活性，这意味着凋亡肿瘤细胞也可以像正常细胞凋亡时那样诱导机体发生免疫耐受。但是本实验对于凋亡CT26细胞抑制小鼠T淋巴细胞增殖及其活性的具体机制没有展开深入研究，实验中部分实验结果无统计学意义可能是样本数不足、仪器测量误差等原因引起，应当在后续研究中进一步分析与验证。

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Effect of apoptotic colorectal cancer CT26 cells on proliferation and activity of T lymphocytes in mice

SUNChao-wen1,2,ZHANGGuang-yu1,ZHAOChen1,2,CHENGHuai-fu1,2,ZHONGLi1,DAILing1

(1DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China;2GraduateSchool,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To investigate the effect of apoptotic colorectal cancer CT26 cells on the proliferation and activity of T lymphocytes in mice.Methods ① Colorectal cancer CT26 cells during logarithmic growth phase were used to prepare apoptotic tumor cells and necrotic tumor cells.T lymphocytes were isolated from the spleens of Balb/c mice,and then cytotoxic T lymphocytes(CTL) were prepared.② The apoptotic tumor cells,necrotic tumor cells and normal tumor cells were cultured with murine CTL separately(taken as apoptotic tumor cell group,necrotic tumor cell group and tumor cell control group,respectively).Then the activity and proliferation of CTL were detected.③ The T lymphocytes of mice were divided into control group,concanavalin A(ConA) group,apoptotic tumor cell+ConA group,necrotic tumor cell+ConA group and living tumor cell+ConA group.The activity and proliferation of T lymphocyte in each group were detected after corresponding treatment.④ Thirty Balb/c mice were selected and divided into apoptotic tumor cell group,necrotic tumor cell group and tumor cell control group,with 10 mice in each group.Apoptotic CT26 cells,necrotic CT26 cells and CT26 cells during logarithmic growth phase were subcutaneously and intravenously infused into mice in corresponding groups.Then the expression of regulatory T cells (Treg) in each group was detected.⑤ Another 30 mice were selected,then were grouped and treated by the way of method ④.The expression levels of soluble Fas(sFas),interleukin(IL)-12,interferon gamma(IFN-γ),IL-4,IL-10 and transforming growth factor beta(TGF-β) in each group were detected.Results The activity andA450 value of CTL in the apoptotic tumor cell group were lower than those in the other two groups(P<0.05).The expression rates of T lymphocytes(including CD69,CD25 and CD71) and number of T lymphocytes during stage G2 or G3 in the apoptotic tumor cell+ConA group were lower than those in the ConA group,living tumor cell+ConA group and necrotic tumor cell+ConA group(P<0.05).The expression level of Treg and relative expression of sFas in the apoptotic tumor cell group were lower than those in the tumor cell group and necrotic tumor cell group(P<0.05).The expression levels of IL-10 and TGF-β were higher and the expression level of IL-12 was lower in the apoptotic tumor cells group compared with the other two groups(P<0.05).The expression level of IL-4 in the apoptotic tumor cells group was higher than that in the tumor cell control group(P<0.05).Conclusion Apoptotic colorectal cancer CT26 cells can inhibit the proliferation and activity if T lymphocytes in mice,and can affect the normal immunological function of mice with colorectal cancer.

Colorectal cancer,CT26 cells,T lymphocytes,Activity,Proliferation,Regulatory T cell,Soluble Fas,Mouse

广西自然科学基金(2012GXNSFAA276035)；广西桂林市科学研究与技术开发计划(20120121-1-13)

孙朝文(1988～)，男，在读硕士研究生，研究方向：消化道恶性肿瘤的诊治，微创外科。

张广钰(1966～)，男，硕士，主任医师，教授，研究方向：消化道恶性肿瘤的诊治，微创外科，E-mail：acrosssky@126.com。

R 735.3；R 392.4

A

0253-4304(2016)09-1201-07

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.04

2016-06-20

2016-07-25)