陈 博 郭晓敏 师 蔚

(陕西省人民医院暨西安交通大学医学院第三附属医院1 神经外科，2 神经内二科，西安市 710068，E-mail：slash0704@sina.com；3西安交通大学医学院第二附属医院神经外科，西安市 710004)

论著·基础研究

脉络丛上皮细胞改良体外纯化培养及其分泌神经再生相关因子的特点▲

陈 博1郭晓敏2师 蔚3

(陕西省人民医院暨西安交通大学医学院第三附属医院1 神经外科，2 神经内二科，西安市 710068，E-mail：slash0704@sina.com；3西安交通大学医学院第二附属医院神经外科，西安市 710004)

目的 探讨脉络丛上皮细胞(CPECs)的体外纯化培养方法及其分泌脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)和胶质源性神经营养因子(GDNF)的特点。方法 取SD新生大鼠侧脑室脉络丛，分离CPECs并进行传代培养及纯化，采用免疫荧光化学法进行CPECs鉴定。将CPECs分为原代培养组(A组)、传1代培养组(B组)及传2代培养组(C组)，并检测各组BDNF、NGF、CNTF和GDNF mRNA及蛋白的表达情况。结果 经荧光显微镜鉴定，所获细胞均为CPECs。BDNF、GDNF的mRNA及蛋白在A组、B组及C组均有表达，B组及C组的表达均较A组降低，C组的表达较B组低(P<0.05)；NGF、CNTF的mRNA及蛋白在A组、B组及C组也均有表达，B组及C组的表达较A组增加，C组的表达较B组低(P<0.05)。结论 改良体外纯化培养CPECs方法可行。CPECs体外具有分泌BDNF、NGF、CNTF和GDNF的能力，而且具有一定周期规律性。

脉络丛上皮细胞；体外；培养；纯化；脑源性神经营养因子；神经生长因子；睫状神经营养因子；胶质源性神经营养因子

脉络丛为神经元的生长发育及轴突的再生提供重要的微环境[1-2]，脉络丛细胞包含了广泛的生物活性物质受体，参与多种活性物质的生成，并经过特异通路将其传送到固定的脑区，通过脑脊液循环影响特异性靶细胞[3-5]。因此，本研究通过改良培养方法，观察在体外纯化培养条件下脉络丛上皮细胞(choroid plexus epithelial cells，CPECs)分泌脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、胶质源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor，GDNF)和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)的特点，为CPECs移植在中枢神经修复机制的研究及应用方面，提供理论参考及实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级SD新生大鼠12只，日龄1 d，重量6～8 g，雌雄不限，由西安交通大学医学院动物中心提供，合格证号：SCXK(陕)2007-001。

1.2 试剂与仪器 DMEM低糖型基础培养基(美国Thermo公司，批号：11965118)，DMEM/F12培养基(美国Thermo公司，批号：11320082)，左旋顺式羟脯氨酸(L-cis-4-hydroxy-proline，L-HP；美国Sigma公司，批号：H54409)，RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒(美国Thermo公司，批号：K1621)，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(日本Takara公司，批号：RR420A)，SuperSignal®West Pico试剂盒(美国Thermo公司，批号：34079)，兔抗转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)抗体(美国Creative Diagnostics公司，批号：DMAB3595)。试验仪器主要有细胞培养箱(Galaxy S)，立体显微镜(SZX16，日本Olympus公司)，倒置相差显微镜，荧光显微镜(BX51，日本Olympus公司)，Image-Pro Plus图像分析管理系统，扫描电子显微镜(JSM-IT100，日本JEOL电子株式会社)，透射电子显微镜( H-7650，日本Hitachi株式会社)。

1.3 方法

1.3.1 CPECs的制备：10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射大鼠以麻醉，用75%乙醇棉球消毒颈部皮肤，剪断颈总动脉放血，断头处死，收集12个大脑并放置在4℃磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS) 溶液中，显微镜下分离脉络丛组织，放置在盛有DMEM基础培养基的烧杯中剪碎并分离。4℃、800 r/min离心5 min，移去上清液。DMEM/F12培养基重悬，移出1份(0.1 ml)细胞悬液，于 0.1 ml 0.4%的台盼蓝混匀，1 min后于倒置显微镜下计数，活细胞呈圆形透明，死细胞染成蓝色。3 min内用计数板分别计数活细胞和死细胞。根据公式计算细胞活力：细胞活力=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。活力>95%有价值。细胞计数后取2 ml细胞悬液接种于Petri培养皿(430165，美国Coring Costar公司)上。

1.3.2 培养条件及纯化方法： 在饱和湿度、95%空气、5% CO2、37℃条件下培养细胞。置于培养箱后6 h，吸出培养液，移入预先用多聚赖氨酸包被的6孔板中，加入含L-HP而不含胎牛血清的DMEM低糖培养基，再次置于培养箱中，48 h后更换培养液，添加有胎牛血清和L-HP的培养基。2 d后清除未贴壁细胞，更换新鲜的添加有胎牛血清和L-HP的培养基，并使用免疫荧光化学法进行CPECs鉴定： 4%多聚甲醛溶液固定细胞爬片10 min并用0.01 mmol/L PBS冲洗3次，正常山羊封闭血清室温孵育30 min，添加兔抗大鼠的TTR抗血清(1 ∶100)室温孵育1 h，4℃过夜。PBS冲洗3次，加入异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔抗体(1 ∶50)于室温下避光孵育2 h。用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)5 mg/L衬染细胞核，室温孵育5 min。避光干燥，甘油碳酸盐缓冲液封片并在荧光显微镜下观察，拍照。

1.3.3 传代培养： 轻轻吹打贴壁的CPECs，使贴壁的细胞悬浮。以1 000 r/min离心5 min，弃上清，吹打使之成为单细胞悬液，调整密度为5×104/ml。在与1.3.2相同的培养箱条件下，使用含有胎牛血清及L-HP的DMEM低糖培养基培养，每3 d更换一次培养液。

1.3.4 实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法检测BDNF、NGF、CNTF和GDNF mRNA的表达： 采用Trizol(美国Invitrogen，批号：15596-018)提取细胞总RNA，5 μg RNA用于反转录，使用RevertAidTM 第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。实时定量PCR反应使用荧光试剂SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ。反应操作中使用三复孔，并选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参基因用于校准目的基因的相对表达，使用原始数据的Ct值运用ΔΔCt法进行计算，得到每个样本中目的基因mRNA的相对表达值。PCR所使用到的引物信息见表1。

1.3.5 Western blot法检测BDNF、NGF、CNTF和GDNF蛋白的表达： 采用二喹啉甲酸法提取细胞蛋白。蛋白使用放射免疫分析法裂解缓冲液进行裂解，浓度使用二喹啉甲酸法进行定量。裂解液按照常规操作步骤在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中上样并进行电泳，转印以及一抗、二抗的抗体孵育，并最终进行曝光。GAPDH作为内参对照。一抗使用兔抗BDNF、NGF、CNTF和GDNF和小鼠抗GAPDH抗体，用山羊抗兔或山羊抗小鼠的辣根过氧化物酶标记二抗。发光信号强度使用SuperSignal®West Pico试剂盒进行底物反应，曝光得到条带。上样量为100 μg。

1.3.6 细胞分组：共分为3组：原代培养组(A组)、传1代培养组(B组)、传2代培养组(C组)。

表1 qRT-PCR所用的引物

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组均数比较采用单因素方差分析，并使用Levene检验进行方差齐性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态学观察及鉴定 倒置相差显微镜下观察可见细胞生长迅速，7 d后细胞铺满培养皿，形态为鹅卵石样，体积大、透明度及折光性强，核仁清晰可见，细胞紧密衔接，融合成片，呈蜂窝状，见图1。应用免疫荧光化学法，在荧光显微镜下进行鉴定，可见TTR标记阳性者呈绿色荧光，细胞核采用DAPI衬染后，呈蓝色荧光，此与TTR阳性的细胞质组合成完整的细胞，见图2。

图1 倒置相差显微镜下CPECs的形态(×40，标尺10 μm)。

图2 荧光显微镜下CPECs形态(免疫荧光化学法染色，×200，标尺50 μm)。

2.2 3组BDNF、NGF、CNTF和GDNF mRNA的表达 BDNF、GDNF在A组、B组及C组均有表达，A组呈高表达，B组及C组的表达均低于A组(P<0.05)，C组的表达较B组低(P<0.05)。NGF、CNTF在A组、B组及C组均有表达，B组及C组的表达均较A组明显增加(P<0.05)，C组的表达较B组低(P<0.05)。见表2。

2.3 3组BDNF、NGF、CNTF和GDNF蛋白的表达 条带照相后扫描光密度，除以内参光密度得到相对表达值。A、B、C三组条带原始光密度值分别为：GAPDH：22 798.75、23 182.74、24 021.17；BDNF：54 051.73、22 536.11、4 932.80；NGF：4 531.68、8 486.17、7 743.99；CNTF：9 748.32、32 401.55、28 487.50；GDNF：30 435.96、13 102.87、4 455.46。用GAPDH校正后，设定A组数据为1，得到A、B、C 3组相对表达值。BDNF、GDNF在A组、B组及C组均有表达，A组呈高表达，B组及C组的表达均较A组降低，C组的表达较B组低(P<0.05)；NGF、CNTF在A组、B组及C组均有表达，B组及C组的表达较A组增加，C组的表达较B组低(P<0.05)。见表3及图3。

表2 3组BDNF、NGF、CNTF和GDNF mRNA的相对表达情况(x±s)

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

表3 3组BDNF、NGF、CNTF和GDNF 蛋白的相对表达情况(x±s)

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

图3 Western blot法检测BDNF、NGF、CNTF和GDNF蛋白的表达。

3 讨 论

既往研究表明，大鼠的背根神经元与脉络丛细胞联合培养可使神经元的生长能力明显增加[6-7]。在大鼠脑梗死模型中进行脉络丛细胞移植，大鼠受损的神经功能可得到不同程度的改善[8-10]。研究表明，脉络丛中可能存在干细胞以及CPECs具有分化成星形胶质细胞的能力[11-15]，证明脉络丛具备了神经修复的条件。目前对CPECs及其生物学特点研究极少，故本研究在前期工作基础上，对CPECs的培养方法及分泌特点进行更深入的研究。

CPECs原代培养较为困难，尤其是在培养过程中易受各种因素的影响，以往的培养方法对CPECs损伤大，并且极易受其他细胞污染，尤其是成纤维细胞等的污染。在纯化过程中CPECs易流失，且培养周期长。本实验采用新生1 d SD大鼠的侧脑室脉络丛为取材对象，在显微镜下，采用精细手术器械，准确分离脉络丛组织，浸于细胞培养基中，眼科剪充分剪碎，肉眼下培养基呈悬浊液。使用注射器针头反复抽吸、吹打，使CPECs从脉络丛组织中游离出来，保持细胞形态完整，又使污染细胞减少。低速离心分离，可去除其他细胞及组织碎片，提高了CPECs的数量和纯度。通常在细胞悬液贴壁最初的2 h尤为关键，此时间段，是进行CPECs培养纯化的最佳时期。使用链霉蛋白酶进行消化，在纯化加入L-HP前使用DMEM/F12细胞培养基有利于细胞在悬浮-贴壁过程中的存活。纯化培养CPECs的经验如下：在取材前，放血法可减少血液对脉络丛的污染；经过2次换液，红细胞消失；对于培养皿，应采用多聚赖氨酸包被，利于CPECs贴壁及增殖，7 d即可铺满培养皿；原代培养时用含10%胎牛血清的培养液，每3 d换液一次；由于CPECs自身可以分泌神经营养因子，培养液不添加表皮生长因子。本研究所用细胞培养液构成简单，配制方便，不需要反复更换，简化操作流程，避免细胞污染。

苏木精- 伊红染色以及电子显微镜用于观察CPECs形态学特点，则免疫荧光化学法多用于细胞鉴定。由于TTR专一性地表达于CPECs，故可采用CPECs的TTR表达阳性作为鉴定CPECs的标准。用抗TTR抗体进行免疫组织荧光染色，是鉴定CPECs最可靠的方法。本研究中，在荧光显微镜下可见TTR标记阳性者胞浆呈绿色荧光，而细胞核采用DAPI衬染后，呈蓝色荧光，提示所获细胞均为CPECs。

BDNF、NGF、CNTF和GDNF均在神经细胞的生存、增殖和分化中起重要作用。本研究结果显示，BDNF、GDNF的mRNA及蛋白在A组、B组及C组均有表达，B组及C组的表达均较A组降低，C组的表达较B组低(P<0.05)；NGF、CNTF的mRNA及蛋白在A组、B组及C组也均有表达，B组及C组的表达较A组增加，C组的表达较B组低(P<0.05)。提示BDNF和GDNF的mRNA及蛋白表达在原代CPECs中最高，随传代逐次降低；NGF和CNTF的mRNA及蛋白表达在传代CPECs中较原代细胞高，在传1代的CPECs中表达最高。这提示在体外培养条件下的CPECs所分泌的神经营养因子和神经生长因子的种类及含量有其规律与特点，不同时期CPECs分泌神经再生相关因子的能力亦不同。由于在不同疾病的不同时期，脑内微环境不尽相同，因此CPECs作为种子细胞应保证其在脑内或脊髓内移植时，可与其他组织工程材料良好符合并固位，发挥其最大效能。选取不同培养时期的CPECs进行足量、联合、配比移植，优于一个培养阶段的CPECs的治疗效果。随着研究的不断深入，CPECs可能在脑外伤、非动脉瘤、非动静脉畸形性脑出血、功能性疾病及肿瘤辅助治疗方面发挥重要作用。

[1] DeChiara TM,Robertson EJ,Efstratiadis A.Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor Ⅱ gene[J].Cell,1991,64(4):849-859.

[2] Torres-Aleman I.Insulin-like growth factors as mediators of functional plasticity in the adult brain[J].Horm Metab Res,1999,31(2-3):114-119.

[3] Nadeau JO,Phillips S,Shi HS,et al.Intracerebral hemorrhage:outcomes and eligibility for factor VIIa treatment in a National Stroke Registry[J].Cerebrovasc Dis,2006,22(4):271-275.

[4] 汤 劼,李 健,李京生,等.人创伤性脑内血肿周边皮质微环境超微结构的研究[J].首都医科大学学报,2006,27(4):524-526.

[5] Horner PJ,Gage FH.Regenerating the damaged central nervous system[J].Nature,2000,407(6 807):963-970.

[6] Borlongan CV,Skinner SJ,Geaney M,et al.CNS grafts of rat choroid plexus protect against cerebral ischemia in adult rats[J].Neuroreport,2004,15(10):1 543-1 547.

[7] Ide C,Kitada M,Chakrabortty S,et al.Grafting of choroid plexus ependymal cells promotes the growth of regenerating axons in the dorsal funiculus of rat spinal cord:a preliminary report[J].Exp Neurol,2001,167(2):242-251.

[8] Chodobski A,Wojcik BE,Loh YP,et al.Vasopressin gene expression in rat choroid plexus[J].Adv Exp Med Biol,1998,449(2-3):59-65.

[9] Borlongan CV,Skinner SJ,Geaney M,et al.Intracerebral transplantation of porcine choroid plexus provides structural and functional neuroprotection in a rodent model of stroke[J].Stroke,2004,35(9):2 206-2 210.

[10]Borlongan CV,Skinner SJ,Geaney M,et al.Neuroprotection by encapsulated choroid plexus in a rodent model of Huntington′s disease[J].Neuroreport,2004,15(16):2 521-2 525.

[11]Blass-Kampmann S,Kindler-Röhrborn A,Deissler H,et al.In vitro differentiation of neural progenitor cells from prenatal rat brain:common cell surface glycoprotein on three glial cell subsets[J].J Neurosci Res,1997,48(2):95-111.

[12]Falk A,Frisén J.Amphiregulin is a mitogen for adult neural stem cells[J].J Neurosci Res,2002,69(6):757-762.

[13]Kotani M,Osanai T,Tajima Y,et al.Identification of neuronal cell lineage-specific molecules in the neuronal differentiation of P19 EC cells and mouse central nervous system[J].J Neurosci Res,2002,67(5):595-606.

[14]Lazaridis I,Charalampopoulos I,Alexaki VI,et al.Neurosteroid dehydroepiandrosterone interacts with nerve growth factor(NGF)receptors,preventing neuronal apoptosis[J] PLoS Biol,2011,9(4):e1 001 051.

[15]Jadhao CS,Bhatwadekar AD,Jiang Y,et al.Nerve growth factor promotes endothelial progenitor cell-mediated angiogenic responses[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(4):2 030-2 037.

Modified purification and culture in vitro for choroid plexus epithelial cells and features of nerve regeneration-related factors secreted by choroid plexus epithelial cells

CHENBo1,GUOXiao-min2,SHIWei3

(1DepartmentofNeurosurgery,2TheSecondDepartmentofNeurology,ShaanxiProvincialPeople′sHospital,theThirdAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710065,China;3DepartmentofNeurosurgery,theSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China)

Objective To explore the approaches to purification and culture in vitro for choroid plexus epithelial cells(CPECs),and features of brain-derived neurotrophic factor(BDNF),nerve growth factor(NGF),ciliary neurotrophic factor(CNTF) and glial-derived neurotrophic factor(GDNF) secreted by CPECs.Methods The choroid plexus of lateral ventricle was obtained from SD neonate rats.Then CPECs were separated,received passage culture and purification,and were identified using immunofluorescence chemistry method.CPECs were divided into primary culture group(Group A),the first passage culture group(Group B) and the second passage culture group(Group C).And the mRNA and protein expressions of BDNF,NGF,CNTF and GDNF were measured in each group.Results The cells obtained were identified as CPECs under fluorescence microscope.The mRNAs and proteins of BDNF and GDNF were expressed in Group A,Group B and group C.The expression level in Group B or C was lower than that in Group A,and the expression level in Group C was lower than that in Group B(P<0.05).The mRNAs and proteins of NGF and CNTF were expressed in Group A,Group B and Group C.The expression level in Group B or C was higher than that in Group A,and the expression level in Group C was lower than that in Group B(P<0.05).Conclusion The modified purification and culture in vitro for CPECs is feasible.CPECs obtain the ability to secret BDNF,NGF,CNTF and GDNF,which has periodic regularity to a degree.

Choroid plexus epithelial cells,In vitro,Culture,Purification,Brain-derived neurotrophic factor,Nerve growth factor,Ciliary neurotrophic factor,Glial-derived neurotrophic factor

国家自然科学基金(81271341)

陈博(1979～)，男，博士，主治医师、讲师，研究方向：神经干细胞及颅底肿瘤。

郭晓敏(1982～)，女，博士，主治医师、讲师，研究方向：神经干细胞及癫痫，E-mail：26880988@qq.com。

R-332

A

0253-4304(2016)09-1192-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.02

2016-03-06

2016-05-20)