潘小敏 吴媛媛 罗志娟 李芳艳 韦欣宏 钟 琳 谢智光

(1 广西中医药大学，南宁市 530011，E-mail：autum19890303@163.com；2 广西中医药大学附属瑞康医院妇科，3 检验科，南宁市 530022；4 广西中医药大学附属第一医院仁爱分院妇科，南宁市 530023)

论著·基础研究

道地通管汤对输卵管炎大鼠转化生长因子-βⅡ型受体和Smad2的mRNA表达的影响▲

潘小敏1吴媛媛2罗志娟2李芳艳1韦欣宏1钟 琳4谢智光3

(1 广西中医药大学，南宁市 530011，E-mail：autum19890303@163.com；2 广西中医药大学附属瑞康医院妇科，3 检验科，南宁市 530022；4 广西中医药大学附属第一医院仁爱分院妇科，南宁市 530023)

目的 观察道地通管汤对输卵管炎大鼠输卵管组织中转化生长因子-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)mRNA和Smad2 mRNA的影响。方法 68只雌性SD大鼠，随机抽取12只作为正常组，剩余大鼠采用混合菌制成输卵管炎模型，建模成功的48只大鼠分为模型组和道地通管汤低、中、高剂量组，各12只。正常组与模型组给予生理盐水灌肠，道地通管汤低、中、高剂量组分别给予不同浓度的道地通管汤灌肠[0.35 g/(100 g·d)、0.7 g/(100 g·d)、1.4 g/(100 g·d)]，并于给药第15天、30天随机抽取每组6只大鼠检测其输卵管组织中TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的相对表达量情况。结果 (1)与正常组比，模型组给药第15、30天时TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表达量均增高(P<0.05)；道地通管汤各剂量组给药第30天时，差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)与模型组比，给药第15、30天时道地通管汤中、高剂量组TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表达量均降低(P<0.05)，给药第15天时道地通管汤低剂量组TGF-βRⅡ的表达量也降低(P<0.05)。(3)道地通管汤各剂量组中TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表达量呈低剂量组>中剂量组>高剂量组，给药第30天时道地通管汤低剂量组与道地通管汤高剂量组的TGF-βRⅡ表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其余组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。(4)道地通管汤各剂量组中，给药第30天时 TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA 的表达量均低于给药第15天，其中道地通管汤各剂量组中Smad2 mRNA 的表达量组内比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 道地通管汤能抑制输卵管炎性大鼠输卵管组织中TGF-βRⅡ和Smad2的mRNA表达；道地通管汤给药30 d作用效果较好，且道地通管汤中剂量与高剂量作用效果相近。

输卵管炎；道地通管汤；转化生长因子-βⅡ型受体；Smad2；信使RNA；大鼠

输卵管炎性疾病可导致异位妊娠、不孕，严重影响患者的身心健康[1]。道地通管汤是罗志娟教授治疗盆腔炎性疾病及输卵管炎性堵塞不孕的经验方，临床疗效显著[2]。实验研究结果显示道地通管汤能改善输卵管炎模型动物血液“黏、稠、滞”的状态[3]，降低血浆C反应蛋白、白介素6的含量[4]，具有抗炎、抗粘连作用，但其具体机制不明确。相关研究显示，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smads 信号转导通路对炎症的发生和发展有重要的影响[5-6]，而道地通管汤是否可通过作用于TGF-β1/Smads信号转导通路相关分子而起抗炎、抗粘连的作用？本实验采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测道地通管汤灌肠后输卵管炎症大鼠输卵管组织中转化生长因子-βⅡ型受体(transforming growth factor-β receptor Ⅱ，TGF-βRⅡ)和Smad2的mRNA含量变化情况，探讨道地通管汤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级雌性SD大鼠68只，体重(220±20)g，8～10周龄，购自广西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(桂)2014-0002，饲养于广西中医药大学实验动物中心。

1.2 材料

1.2.1 药物：道地通管汤水煎浓缩至生药含量为1.75 g/ml、3.5 g/ml、7.0 g/ml的溶液。

1.2.2 混合菌：将金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠杆菌按1 ∶1 ∶2比例用无菌生理盐水配成3×108/ml的混合液。

1.2.3 主要试剂：Trizol-A+Reagent总RNA提取试剂盒(北京天根公司，批号：DP421)，FastQuant cDNA第一链合成试剂(北京天根公司，批号：KR106)，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(大连宝生物公司，批号：AK6503)，引物由上海生物工程技术有限公司合成。

1.2.4 主要仪器：紫外可见分光光度计(美国Thermo公司，型号：NanoDrop2000)，大容量冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司，型号：Eppendorf 5810R)，ABI实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司，型号：StepOnePlus)等。

1.3 造模方法 68只雌性SD大鼠，采用随机数字表法抽取12只作正常组，对其余56只大鼠进行造模。采用混合菌造模法[7]，选择动情后期雌性大鼠，用10%水合氯醛溶液0.3 ml/100 g腹腔注射后，仰卧固定、剃毛、消毒、铺布，行纵形切口，打开腹腔，找到Y形子宫，分别在子宫角近输卵管处注射细菌混悬液0.05 ml，缓慢注射，每侧注射混合菌液 0.05 ml，然后将输卵管纳回腹腔，用1号丝线先缝合腹壁再缝合皮肤，75%酒精消毒手术伤口，正常组不做任何处理。术后将大鼠侧卧位放于鼠笼内，每只大鼠单独放于一个笼，待其自然苏醒，再观察术后大鼠的情况，造模术后所有大鼠自由饮食，使用普通饲料喂养，不使用抗生素治疗。使用随机数字表法分别于术后第5、10、15天选取1只大鼠及术后第20天选取2只大鼠，剖腹观察记录其输卵管盆腔变化情况，截取输卵管组织使用苏木精-伊红染色，检测其病理形态学变化，以确定输卵管炎模型造模成功。

1.4 给药方法 56只进行造模的大鼠中，3只急性感染死亡，5只用于确定造模成功，剩余48只采用随机数字表法分为模型组、道地通管汤低剂量组、道地通管汤中剂量组、道地通管汤高剂量组，每组12只。造模术后第21天开始灌肠，正常组与模型组给予生理盐水0.2 ml/(100 g·d)，道地通管汤低、中、高剂量组分别给予不同浓度的水煎浓缩液[0.35 g/(100 g·d)、0.7 g/(100 g·d)、1.4 g/(100 g·d)，分别等效于人临床常规量的1/2和1、2倍]灌肠。

1.5 标本的采集与制备 给药第15、30天，采用随机数字表法分别抽取每组6只大鼠，打开腹腔截取输卵管组织迅速放于冻存管投入液氮过夜后保存于-80℃冰箱，采用qRT-PCR进行检测。

1.6 TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA表达情况 按Trizol法提取大鼠输卵管组织的总RNA；按反转录试剂盒操作步骤合成cDNA；采用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，反应条件：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。PCR实验数据分析采用相对定量方法，计算方法选择2-ΔΔCt法。引物见表1。

表1 β-actin、TGF-βRⅡ、Smad2引物序列与产物长度

注：β-actin为β-肌动蛋白。

1.7 统计学分析 采用SPSS 22软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组均数的比较采用单因素方差分析；道地通管汤各组组内用药15 d与30 d的比较采用配对资料t检验或符号秩检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组TGF-βRⅡmRNA相对表达量比较 与正常组比，给药第15、30天模型组 TGF-βRⅡ mRNA表达量增高(P<0.05)，道地通管汤各组表达量有不同程度增高，其中与给药第15天时道地通管汤低、中剂量组的差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比，道地通管汤各组表达量有不同程度降低，除给药第15天时的道地通管汤低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)外，其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)。道地通管汤各剂量组中，TGF-βRⅡ mRNA表达量呈低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仅给药第30天时，道地通管汤低剂量组与道地通管汤高剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。道地通管汤各剂量组中，给药第30天TGF-βRⅡ mRNA表达量均低于给药第15天，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 给药后各组大鼠输卵管组织中 TGF-βRⅡ mRNA相对表达量比较(x±s)

注：与正常组比较：*P<0.01；与模型组比较：#P<0.05。

2.2 各组Smad2 mRNA相对表达量比较 (1)与正常组比较，模型组Smad2 mRNA表达量增多(P<0.05)，道地通管汤各剂量组表达量不同程度增高，但差异均无统计学意义(P>0.05)；与模型组比，道地通管汤各组Smad2 mRNA表达量有不同程度降低，其中与给药第15、30天时道地通管汤中、高剂量组的差异均有统计学意义(P<0.05)；道地通管汤各剂量组Smad2 mRNA呈低剂量组>中剂量组>高剂量组，但组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)道地通管汤各剂量组中，给药第30天Smad2 mRNA均低于给药第15天，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 给药后各组大鼠输卵管 组织中Smad2 mRNA相对表达量比较(x±s)

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨 论

大量研究表明TGF-β1/Smads信号转导通路是炎症发挥作用的主要途径[5-6]。在炎症刺激下，TGF-β1通过血纤维蛋白溶酶、活性氧、血小板-1和酸的作用从结合蛋白中水解分裂出来[8-9]，激活的TGF-β1结合其受体，通过分泌的方式发挥生物学作用[6]。TGF-β1最先结合TGF-βRⅡ，从而激活TGF-βRⅠ激酶，使受体调节型Smad2、Smad3磷酸化，继而联合Smad4成为一个Smad复合体；Smad复合体进入细胞核内发挥促使成纤维细胞增生的相关生物学效应，使胶原蛋白趋化为单核细胞、成纤维细胞等，使细胞外基质沉淀，最终导致TGF-β1/Smads信号通路反复被激活，进而使细胞内钙离子增多，导致白介素6、肿瘤坏死因子大量释放，由此产生的炎症因子又存在正反馈的效应，而加强炎症反应；其中当炎症发生时，TGF-β1/Smads信号转导通路的TGF-βRⅡ和Smad2表达增多，而炎症好转时，TGF-βRⅡ和Smad2表达减少[10-12]。

本课题组的前期实验已证实道地通管汤具有抗炎、抗粘连的作用[3-4]。本实验结果显示，模型组大鼠输卵管组织TGF-βRⅡ与Smad2 mRNA 的表达量均高于正常组(P<0.05)；且与模型组比，给药第15、30天时道地通管汤中、高剂量组TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表达量均降低(P<0.05)，给药第30天时道地通管汤低剂量组TGF-βRⅡ的表达量也降低(P<0.05)。这提示道地通管汤可能通过抑制 TGF-βRⅡ与Smad2的mRNA的表达，从而起到抗炎、抗粘连的作用。

本实验结果还显示，给药30 d时，道地通管汤各剂量组TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表达量与正常组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，且中、高剂量组TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA的表达量接近正常组；而道地通管汤中剂量组与高剂量组TGF-βRⅡ和Smad2 mRNA 的表达量比较，差异也均无统计学意义(P>0.05)。这提示道地通管汤给药30 d作用效果较好，且道地通管汤中剂量与高剂量作用效果相近。对于道地通管汤各剂量组两两比较以及组内比较部分无统计学差异，这可能与本研究样本量少有关。

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Effect of Daodi Tongguan decoction on expressions of transforming growth factor-betareceptor Ⅱ and Smad2 mRNAs in rats with salpingitis

PANXiao-min1,WUYuan-yuan2,LUOZhi-juan2,LIFang-yan1,WEIXin-hong1,ZHONGLin4,XIEZhi-guang3

(1GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530011,China;2DepartmentofGynaecology,3DepartmentofClinicalLaboratory,RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530022,China;4DepartmentofGynaecology,Ren′aiDivision,theFirstAffiliatedHospitaltoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530023,China)

Objective To observe the effect of Daodi Tongguan decoction on the expressions of transforming growth factor-β receptor Ⅱ(TGF-βRⅡ) mRNA and Smad2 mRNA in fallopian tube tissues of rats with salpingitis.Methods Twelve of 68 female SD rats were selected randomly as the normal group,and salpingitis models were established using mixed bacteria in the rest rats.The 48 successful rat models were divided into model group,low-,medium- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups,with 12 rats in each group.The rats in the normal group and model group were given normal saline by enemata,while the rats in the low-,medium- and high-Daodi Tongguan decoction groups were given Daodi Tongguan decoction with the concentrations of 0.35 g/(100 g·d),0.7 g/(100 g·d) and 1.4 g/(100 g·d) by enemata respectively.On the 15th and 30th day after administration,six rats were randomly selected from each group to detect the relative expressions of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in their fallopian tube tissues.Results ① Compared to the normal group,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in the model group increased on the 15th and 30th day after administration (P<0.05);on the 30th day after administration,no significant differences in the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs were found among all Daodi Tongguan decoction groups(P>0.05).② Compared to the model group,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in the medium- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups decreased on the 15th and 30th day after administration(P<0.05),and the expression quantity of TGF-βR Ⅱ in the low-dose Daodi Tongguan decoction group also decreased on the 15th day after administration(P<0.05).③ Among all Daodi Tongguan decoction groups,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs deceased in the order of low-,medium- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups.There was significant difference in the expression quantity of TGF-βR Ⅱ between the low- and high-dose Daodi Tongguan decoction groups(P<0.05),and no statistical difference was observed among other Daodi Tongguan decoction groups(P>0.05).④ Among the Daodi Tongguan decoction groups,the expression quantities of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs on the 30th day after administration were lower than those on the 15th day,and the statistical difference was found in the expression quantity of Smad2 mRNA among the Daodi Tongguan decoction groups(P<0.05).Conclusion Daodi Tongguan decoction can inhibit the expressions of TGF-βR Ⅱ and Smad2 mRNAs in fallopian tube tissues of rats with salpingitis.The efficacy is better on the 30th day after administration,and the medium-dose Daodi Tongguan decoction obtains a similar efficacy as the high-dose Daodi Tongguan decoction.

Salpingitis,Daodi Tongguan decoction,Transforming growth factor-βreceptor Ⅱ,Smad2,Message RNA,Rat

国家自然科学基金(81360594)

潘小敏(1989～)，女，在读硕士研究生，研究方向：不孕不育与生殖内分泌。

罗志娟(1960～)，女，本科，教授，研究方向：不孕不育与生殖内分泌、妇科炎症，E-mail：lzj60123@163.com。

R 285.5

A

0253-4304(2016)09-1189-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.01

2016-04-14

2016-06-20)