刘坤友 周 艳 陈桂生 刘凤玲 李 明

(1 广西柳江县人民医院检验科，柳江县 545100，E-mail：Ljrylky@163.com；2 广西壮族自治区疾病预防控制中心，南宁市 530028)

苦丁茶和小飞扬草对多重耐药性大肠杆菌外排泵acrA基因表达的影响▲

刘坤友1周 艳2陈桂生1刘凤玲1李 明1

(1 广西柳江县人民医院检验科，柳江县 545100，E-mail：Ljrylky@163.com；2 广西壮族自治区疾病预防控制中心，南宁市 530028)

目的 探讨苦丁茶、小飞扬草水提物对多重耐药性大肠杆菌外排泵acrA基因表达的影响。方法 用纸片扩散法筛选多重耐药性大肠杆菌，试管二倍稀释法检测苦丁茶、小飞扬草水提物和阿莫西林对多重耐药菌株的最低抑菌浓度(MIC)，用1/2 MIC浓度的苦丁茶、小飞扬草水提物干预多重耐药菌株，72 h后检测阿莫西林的MIC；选取苦丁茶和小飞扬草干预前后的耐药菌株进行荧光实时定量PCR检测外排泵基因acrA mRNA的表达。结果 筛选出3株多重耐药性大肠杆菌，苦丁茶或小飞扬草干预后阿莫西林对多重耐药株的MIC明显低于干预前(P<0.05)；苦丁茶或小飞扬草干预后acrA mRNA的表达量均较干预前明显降低(P<0.05)。结论 苦丁茶和小飞扬草对多重耐药性大肠杆菌有明显抑制作用，其机制可能是与通过降低多重耐药性大肠杆菌外排泵acrA基因mRNA的表达量有关。

大肠杆菌；多重耐药；苦丁茶；小飞扬草；外排泵；acrA基因

大肠杆菌广泛分布于自然界，其大部分血清型是肠道正常菌群，但一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性，常引起婴儿和幼畜(禽)严重腹泻和败血症。近年来，由于抗生素的不合理使用，大肠杆菌对抗生素耐药的问题越来越突出，多重耐药率越来越高，这降低治疗效果，增加治疗成本，已成为全球的公共卫生问题之一。致病性大肠杆菌感染在社区及医院中多为散发病例，治疗较为困难，如有交叉感染可造成暴发流行，对婴幼儿、免疫缺陷者和老年人造成严重威胁[1]。因此，大肠杆菌的多重耐药机制已成为一个研究热点。细菌外排泵在多重耐药中起重要作用。本研究旨在探讨苦丁茶、小飞扬草对多重耐药大肠杆菌株外排泵基因的作用，从而为逆转耐药、降低多重耐药率提供参考。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源及实验材料 2014年1月至2015年5月广西柳江县人民医院、柳州市疾病预防控制中心门诊部初诊、未使用抗生素治疗的腹泻、腹痛患者385例，收集其粪便，按常规分离、培养大肠植菌，经生物梅里埃公司-梅里埃中国VITEK AMS 60系统鉴定为大肠埃希菌。本实验所用的氧氟沙星、红霉素、四环素、青霉素、阿莫西林的标准药敏纸片均由杭州天和微生物试剂有限公司提供。苦丁茶和小飞扬草、阿莫西林分散片(规格0.25 g/片，批号20130171)购自石药集团中诺药业有限公司。以大肠埃希菌标准菌株ATCC25922作质量控制菌株，由广东省微生物种质资源库提供。Trizol试剂盒购自上海Invitrogen公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和DNase I购自Fermentas公司；2×SYBR Green qPCR Mix购自北京庄盟有限公司。PCR上游引物为5′-GTTCGTCCTCAAGTTAGCG-3′，下游引物为5′-GTCACCAGCCACTTATCG-3′；内参上游引物为5′-ATCAACGACCTGTTAGACG-3′，下游引物为5′-ACAGACCAGTTGCTTCAG-3′，由上海生物工程技术服务公司合成。

1.2 多重耐药株的筛选 (1)称取Mueller-Hinton(M-H)琼脂38 g、蒸馏水1 L，高压灭菌后按25 ml/平皿(直径约9 mm)进行分装。(2)菌种孵育16～24 h后，分别接种于生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108CFU/ml)。(3)用无菌棉签蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液，然后在M-H琼脂表面均匀涂布3次接种，每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹1圈。(4)将M-H琼脂平板在室温下干燥3～5 min，再用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面，置于35℃恒温箱内孵育16～18 h，观察并记录抑菌圈的直径。(5)药敏试验用纸片扩散法，按照美国临床实验室标准委员会制订的操作步骤[2]，重复操作3次，取3次的平均值为该药敏纸片的抑菌直径，青霉素、红霉素药敏纸片抑菌直径<13 mm为耐药，氧氟沙星、四环素药敏纸片抑菌直径≥12 mm为耐药，阿莫西林纸片抑菌直径<10 mm为耐药，3种或3种以上抗生素耐药的菌株，确定为多重耐药株。

1.3 苦丁茶、小飞扬草水提物制备 采用煮沸法提取药液[3-4]，称取干燥的苦丁茶50 g，加水过药面浸泡30 min，武火煮沸后用文火煎煮，文火煎煮时间第1次为1.5 h，第2次为40 min，第3次为30 min，分别滤取煮液，将3次药液合并后浓缩至100 ml(相当于0.5 g/ml生药)；再取浓缩液40 ml，文火将其浓缩为5 ml浓缩液(相当于4.0 g/ml生药)，灭菌备用。小飞扬草水提物制备方法同苦丁茶。

1.4 最低抑菌浓度检测 采用二倍稀释法[2]测定苦丁茶、小飞扬草水提物和阿莫西林对大肠杆菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。用肉汤培养基和苦丁茶、小飞扬草水提液混合配置浓度分别为2.0 g/ml、1.0 g/ml、0.5 g/ml、0.25 g/ml，肉汤培养基和阿莫西林混合配置浓度分别为16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml、128 μg/ml，从筛选出来的多重耐药菌中选取3株，校正浓度至 0.5麦氏标准(相当于1.0×108CFU/ml)，取多重耐药菌株菌液1 μl(相当于1.0×105CFU/ml)和含药液的培养基混合培养24 h，用棉签取培养液涂布于M-H琼脂平板，观察菌落生长情况，根据是否有生长判断MIC。

1.5 苦丁茶和小飞扬草水提物作用前、后对多重耐药株的药敏试验 上述检测阿莫西林对多重耐药的MIC即苦丁茶和小飞扬草水提物作用前阿莫西林对多重耐药菌株的MIC；将筛选的3株多重耐药菌株分别经1/2 MIC浓度的苦丁茶和小飞扬草水提物干预72 h，方法同“1.4”。取诱导培养后的耐药菌株检测阿莫西林的MIC即苦丁茶和小飞扬草水提物作用后阿莫西林对多重耐药菌株和标准菌株的MIC。同时设立阴性对照组，该组是用培养液诱导标准菌株ATCC25922，测定阿莫西林对多重耐药菌株和标准菌株的MIC。

1.6 荧光实时定量PCR检测

1.6.1 RNA抽提：按照RNA按照试剂盒说明书进行提取苦丁茶和小飞扬草水提取物干预前、后耐药菌株总RNA。

1.6.2 反转录：20.0 ml反应体系，在0.2 ml PCR管中加入5 ml总RNA、1 ml引物(0.2 mg/ml)、5 ml双蒸水，70℃温浴5 min，冰浴10 s，10 000 r/min离心1 min，加入4.0 ml缓冲液、2.0 ml三磷酸脱氧核苷(10 mmol/L)、1.0 ml RNA酶抑制剂(20 U/ml)、2.0 ml反转录酶(10 U/ml)，37℃温浴5 min，42℃温浴60 min，70℃温浴10 min，终止反应，将上述溶液-20℃保存。

1.6.3 荧光定量PCR检测：cDNA样品稀释到1/6，反应体系20 ml，把10 ml SYBRGreen qPCR Master Mix、1 ml上游引物(10 μM)、1 ml下游引物(10 μM)、7 ml ddH2O、1 ml cDNA混合配制反应混合液；热循环反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性10 s，60℃退火40 s，共40个循环。

1.6.4 计算目的基因的相对表达量：采用2-△△CT法[5]对荧光实时定量PCR的数据进行相对定量分析，计算公式为：△CT=CT目的基因-CT内参基因；△△CT=△CT目的基因-对照组目的基因△CT平均值；采用2-△△CT表示目的基因的相对表达量。

1.7 统计学分析 采用SPASS 11.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，两组均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 多重耐药筛选结果 筛选出3株多重耐药，均表现为对青霉素、红霉素、四环素和阿莫西林耐药，分别命名为多重耐药菌株1、2、3。

2.2 苦丁茶对、小飞扬草水提物对多重耐药的MIC 苦丁茶、小飞扬草水提物对多重耐药菌株1、2的MIC均高于诱导标准菌株ATCC25922的MIC，对多重耐药菌株3的MIC和标准菌株一致。见表1。

表1 苦丁茶和小飞扬草水提物对多重耐药菌株的MIC(g/ml)

2.3 苦丁茶、小飞扬草水提物干预前后阿莫西林对多重耐药菌株的MIC 苦丁茶、小飞扬草水提物干预前，以及阴性对照组阿莫西林对多重耐药菌株的MIC均为64 μg/ml；苦丁茶、小飞扬草水提物干预后，对阿莫西林多重耐药株的MIC明显低于干预前(苦丁茶t=8.582，P<0.001；小飞扬草t=9.376，P<0.001)，见表2。

表2 苦丁茶和小飞扬草水提物干预前后阿莫西林对多重耐药株的MIC(μg/ml)

2.4 苦丁茶和小飞扬草水提物干预前后多重耐药菌株acrA mRNA的表达 苦丁茶和小飞扬草干预后acrA mRNA的表达量均较干预前明显降低(苦丁茶t=3.545，P=0.024；水飞扬草t=3.102，P=0.038)，见表3。

表3 苦丁茶和小飞扬草水提物干预前后多重耐药菌株acrA基因mRNA的表达(2-△△CT)

3 讨 论

由于抗生素不合理使用引起的细菌耐药，已成为21世纪威胁人类生命健康的最重要元凶之一。实验证实，清热解毒类中药的抗菌作用较强，被称为植物性抗生素，如黄连、黄芩、黄柏、板蓝根、夏枯草、连翘、丹皮、虎杖、贯众等[4]。我国的中草药资源丰富，细菌、病毒等病原体不容易对其产生耐药性，具有良好的临床应用前景。有学者认为从天然药物中寻找高效低毒的抗菌成分，研发新的抗菌药物，这可能是解决细菌多重耐药的新途径[6]。

苦丁茶性味苦甘，具有清热凉血、驱散风热、消除烦渴、滋养肝肾之功效，临床上可用于治疗痢疾、腹泻、热病烦渴、牙痛目赤等病症。药物化学分析表明，苦丁茶的抗菌成分主要为咖啡酸甲酯、香草醛、没食子酸、咖啡酸、β-谷甾醇、对羟基苯甲醛、阿魏酸等[7]。有实验证明，苦丁茶对甲链球菌、肺炎球菌、乙型链球菌、白喉杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、大肠杆菌、卡他球菌等有抑制作用，灌服苦丁茶水提物能明显提高大肠杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌及乙链球菌感染小鼠的存活率[8]。

小飞扬草味辛、酸，性凉，有小毒。有清热解毒、利湿止痒、通乳之功效，临床常用于肺痈、乳痈、疔疮肿毒、痢疾、泄泻、热淋等病证。实验证明，小飞扬草对大肠杆菌、枯草杆菌、抗幽门螺杆菌等有较强的抑制作用[9-10]。

本课题组在前期研究中发现苦丁茶和小飞扬草对多重耐药大肠杆菌有明显的抑制作用[11]。目前尚无关于苦丁茶和小飞扬草通过调控外排泵基因抑制或杀灭大肠杆菌的报告。细菌外排泵是病原微生物将体内的有毒物质运到细胞外环境的一种跨膜蛋白质，抗生素很容易诱导细菌外排泵超表达，使细菌在不利环境中生存繁殖[12]。具有超表达外排泵的菌株还可导致其他抗菌药物作用靶点的变异，使细菌发生多重耐药，可见细菌外排泵超表达是形成细菌多重耐药的重要机制之一。大肠杆菌药物外排泵较多达37种[13]，其中AcrAB-TolC外排泵是在大肠埃希菌中占绝对优势的外排泵，在大肠杆菌中广泛存在，其能将抗菌药物、有机溶剂、染料等排出细菌体外[14]。有实验表明，外排泵被抑制后，细菌可重新恢复对抗菌药物的敏感性，这为研制抗耐药菌药物提供了新的思路。排泵抑制剂的作用机制可能有3条途径,一是干扰外排泵组装，二是阻断外排泵能量来源，三是阻碍底物通过外排通道[15]。本文结果显示，苦丁茶或小飞扬草干预后阿莫西林对多重耐药株的MIC明显低于干预前(P<0.05)；苦丁茶和小飞扬草干预后acrA mRNA的表达量均较干预前明显降低(P<0.05)，说明苦丁茶和小飞扬草对多重耐药性大肠杆菌具有较好的抑菌作用，其机制可能是下调外排泵acrA mRNA表达，促使菌体内药物外排量减少、储存量增加，从而提高大肠杆菌对药物的敏感性。这与Xu等[13-14]的报告结果相符。不同菌株acrA mRNA的表达量不尽相同，这可能与菌株的差异有关，也可能还与外排泵的其他调控基因有关。本实验没有检测大肠杆菌的全部外排泵基因，今后将进一步增加外排泵基因的研究，为解决大肠杆菌多重耐药性问题提供更加充实的参考。

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Effect of broadleaf holly leaf and thymifolious euphorbia herb on efflux pumps acrA gene expression of multidrug-resistantEscherichiacoli

LIUKun-you1,ZHOUYan2,CHENGui-sheng1,LIUFeng-ling1,LIMing1

(1Departmentof,thePeople′sHospitalofLiujiangCounty,Liujiang545100,China; 2Departmentof,GuangxiCenterforDiseasePreventionandControl,Nanning530028,China)

Objective To explore the effect of broadleaf holly leaf and thymifolious euphorbia herb extracts on efflux pumps acrA gene expression of multidrug-resistantEscherichiacoli.Methods The multidrug-resistantEscherichiacoliwas screened using disk diffusion test.The minimal inhibitory concentrations(MIC) of broadleaf holly leaf extracts,thymifolious euphorbia herb extracts and amoxicillin for multidrug-resistant bacterial strains were detected by tube double dilution method.The multidrug-resistant bacterial strains were treated by the extracts of broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb with the concentration of 1/2 MIC,and then the MIC of amoxicillin was detected 72 hours later.The expression of efflux pumps gene acrA mRNA was detected in multidrug-resistant bacterial strains before and after being treated with broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb using quantitative real-time PCR.Results Three strains of multidrug-resistantEscherichiacoliwere screened.MIC of amoxicillin for multidrug-resistant bacterial strains was significantly lower after intervention with broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb compared to that before intervention(P<0.05).The expression of acrA mRNA after intervention with broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb was significantly lower than that before intervention(P<0.05).Conclusion Broadleaf holly leaf and thymifolious euphorbia herb can obviously inhibit multidrug-resistantEscherichiacoli.And the mechanism may be related to the inhibition on the expression of efflux pumps acrA gene in multidrug-resistantEscherichiacoli.

Escherichiacoli,Multidrug-resistance,Broadleaf holly leaf,Thymifolious euphorbia herb,Efflux pumps,acrA gene

广西医药卫生科研课题(Z2010047)

刘坤友(1973～)，男，本科，副主任技师，研究方向：医学检验。

周艳(1969～)，研究生，副主任技师，研究方向：微生物检验与质量控制、公共卫生管理与人力资源管理，E-mail：149024033@qq.com。

R 284

A

0253-4304(2016)02-0207-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.17

2015-10-18

2016-01-20)