李学渊 张 扬 田 文 孙英贤 张光伟 姜大庆

(中国医科大学附属第一医院，1 心内科，沈阳市 110001，E-mail：llxxyy2002@sohu.com；2 沈阳医学院附属中心医院手外科，沈阳市 110000；中国医科大学附属第一医院，3 干诊科，4 心外科，沈阳市 110001)

大鼠心肌干细胞体外分离培养的方法研究▲

李学渊1张 扬2田 文3孙英贤1张光伟4姜大庆4

(中国医科大学附属第一医院，1 心内科，沈阳市 110001，E-mail：llxxyy2002@sohu.com；2 沈阳医学院附属中心医院手外科，沈阳市 110000；中国医科大学附属第一医院，3 干诊科，4 心外科，沈阳市 110001)

目的 对比不同温度下采用纤维黏连蛋白(FN)包被分离培养大鼠心肌干细胞(CSC)的效果，以筛选体外大鼠心肌干细胞的最佳分离培养方法。方法 选取健康新生Wistar大鼠，在无菌条件下取出心脏，分别经胰酶和Ⅱ型胶原酶反复消化后于FN包被的培养瓶中培养，将第3代CSC进行免疫组化细胞表面抗原鉴定。将在37℃及室温(22℃～25℃)下用FN包被培养的原代细胞分别设为A组及B组，在37℃及室温(22℃～25℃)下用FN包被培养的CSC分别设为C组及D组，比较A组与B组、C组与D组的细胞贴壁时间、首次传代时间及细胞倍增水平。结果 从新生大鼠心肌组织内成功分离培养出CSC，细胞表面抗原c-kit阳性率为83%。A组及C组的贴壁时间、首次传代时间分别均短于B组、D组(P<0.05)。细胞倍增水平呈C组>A组>D组>B组。结论 应用37℃FN包被培养瓶的方法分离培养原代大鼠心肌干细胞效果更优。

心肌干细胞；细胞分离；细胞培养；大鼠

既往认为心肌细胞不可再生，但已有研究证明在心肌组织内存在一种可再生的细胞——心肌干细胞(cardiac stem cell，CSC)[1-3]。CSC分有多种亚群，其中表面抗原c-kit阳性细胞是CSC亚群中研究最为广泛的一种细胞[4]。CSC具有干细胞的特性，包括自身再生能力、分化能力等[3]。有学者通过使用多种干细胞治疗缺血心脏病，发现与骨髓间充质干细胞及骨髓单个核细胞比较，CSC改善心功能的效果最为显著[5-6]。虽然已从心肌组织中成功分离出CSC，但由于CSC数量少，应用磁珠分选培养价格昂贵且影响细胞存活率，目前还没有一种统一高效的培养方法。本研究比较了不同条件下采用纤维黏连蛋白(fibronectin，FN)包被的培养瓶分离培养大鼠CSC的效果，旨在优化实验过程中的一些条件，为进一步研究CSC的生物活性和临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康新生Wistar大鼠10只，日龄1～2 d，雌雄不限，体重6～8 g，购自中国医科大学动物部，使用许可证号：SYXK(辽)2013-0007，处死前与母鼠共同饲养。

1.2 主要试剂与仪器 VT-840K-U型洁净工作台(中国苏州安泰空气技术有限公司)，HERA Cell 150型CO2培养箱(德国Heraeus公司)，ST-21型台式离心机(美国Sorvall公司)，25 cm2细胞培养瓶(Biofil)，AX70型倒置光学显微镜及显微照相系统(日本Olympus公司)，依斯考夫改进的杜尔贝科培养基(Iscoves modified Dulbecco medium，IMDM，Hyclone公司)，胎牛血清(ExCell公司)，L-谷氨酰胺(Gibco公司)，多聚D赖氨酸(poly-D-lysine，PDL；Sigma公司)，FN(武汉博士德)，青链霉素混合液100×(Solarbio公司)，75%酒精(美华)，免疫组化试剂盒(博士德生物，SA1052)，c-kit一抗(武汉博士德，BA0467-1)，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS，Hyclone公司)，胰酶(Solarbio公司)，4%多聚甲醛(国药集团)，Ⅱ型胶原酶(Gibco公司)。

1.3 CSC提取 新生1～2 d的小鼠断颈处死后置于75%酒精内约30 s，消毒后用无菌纱块捏住乳鼠背部以固定乳鼠，眼科剪剪开心前区胸壁，取出整个心脏置于预先加有PBS的培养皿中，再将大鼠心脏移入超净台中预先放入PBS的无菌培养皿中，予杜氏磷酸缓冲盐液(Dulbecco′s phosphate buffered saline，DPBS)洗去血污后剪成约0.5～1 mm3的组织块，切除心耳组织周围的结缔组织、脂肪组织及纤维组织。再次用滴管吸取2～3 ml DPBS反复冲洗至洗涤液澄清，弃去洗涤液。加入1～2 ml 0.25% 胰酶(不含乙二胺四乙酸)，以盖住所有组织块为宜，室温消化5 min，消化期间，继续将组织块剪碎至大小约0.5 mm3的组织块，吸弃消化液。再用1～2 ml 0.1% Ⅱ型胶原酶室温消化5 min，吸弃消化液。胰酶和 Ⅱ 型胶原酶交替消化3次，消化完毕后加入1～2 ml完全移植物培养液(complete explants medium，CEM；成分：IMDM，20%胎牛血清，100 U/ml青霉素G，100 g/ml链霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺)终止消化。将培养皿中的组织块用CEM重悬后平铺到预先用FN(4 μg/ml)包被的培养瓶中，24 h后换液，将吸出的原瓶中的培养基平铺到另一预先用纤维FN包被的培养瓶中培养。当细胞生长到80%融合时采集心肌球形成细胞。细胞生长至80%融合时传代至预先用PDL(40 μg/ml)包被的培养瓶中培养，应用心肌球生长培养基(cardiosphere-growing medium，CGM；成分：IMDM，10%胎牛血清，100 U/ml青霉素G，100 g/ml链霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺)培养。3～4 d换液1次。观察有心肌球形成时轻轻吹打，使心肌球脱离下来，收集培养液于15 ml离心管中，4℃，800 r/min离心5 min，CEM重悬心肌球源性细胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)，平铺于FN包被的培养瓶中，每2～3 d换液1次。

1.4 CSC表面抗原鉴定 分别取原代细胞和CDCs行免疫组化细胞表面抗原c-kit鉴定。细胞用4%多聚甲醛室温固定30 min，3%冰乙酸室温浸泡20 min，以灭活内源酶，蒸馏水洗1～2次。滴加5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封闭液，室温封闭20 min，甩去多余液体，不洗。滴加1 ∶100稀释后的c-kit一抗，4℃过夜。PBS洗3次，每次2 min。滴加二抗IgG，37℃孵育20 min后，PBS洗3次，每次2 min。滴加碱性磷酸酶标记链酶亲和素，37℃孵育20 min，PBS洗4次，每次5 min，再水洗1次。用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四氮唑1 ∶20稀释后显色120 min，蒸馏水清洗。用核固红轻度复染核，水洗，干燥后显微镜观察。

1.5 细胞分组 (1)原代提取细胞按随机数字表法分为A组和B组，每组5瓶细胞(25 ml塑料培养瓶)，A组细胞培养瓶在细胞培养前预先于37℃ FN包被2 h，B组细胞培养瓶预先于室温(22℃～25℃)FN包被2 h，比较各组细胞贴壁时间、首次传代时间及细胞倍增水平。(2)将所获得的CDCs细胞按随机数字表法分为C和D组，每组5瓶细胞(25 cm2塑料培养瓶)，C组细胞培养瓶在细胞培养前预先于37℃ FN包被2 h，D组细胞培养瓶预先于室温(22℃～25℃)FN包被2 h，比较各组细胞贴壁时间、首次传代时间以及细胞倍增水平。每天镜下计数细胞，细胞倍增水平=总细胞数/种植细胞数。

1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CSC生长情况 (1)心肌组织块植入培养瓶后，1～3 d 细胞贴壁生长，并可见细胞自心肌组织块边缘爬出，呈同心圆向周围生长。亦可见成簇细胞团和细胞规律搏动；2～3周后长满培养瓶，可行传代培养，见图1。(2)传代后细胞成簇贴壁生长，7～10 d后，有成簇的细胞成球形漂浮在培养基中，心肌球形成后可将其种于FN包被的培养瓶中培养，见图2。(3)提取的心肌球细胞贴壁生长(见图3)，随着细胞数增多，细胞呈同心圆并成簇生长，待细胞达到78%～80%融合时即可传代培养。

2.2 CSC鉴定情况 获得的CSC行细胞表面抗原免疫组化鉴定，c-kit阳性率83%，并见搏动细胞，见图4。

图1 倒置显微镜下原代细胞培养情况(×10)图2 倒置显微镜下观察心肌球形成(×10)图3 倒置显微镜下心肌球源性细胞贴壁生长情况(×10)图4 CSC表面抗原c⁃kit鉴定(细胞免疫化学染色，×10)

2.3 各组细胞贴壁时间、首次传代时间及细胞倍增水平的比较 (1)在原代培养时应用不同的FN包被方法，A组的细胞贴壁时间为(1.4±0.5)d，短于B组的(2.0±0.7)d，但差异无统计学意义(t=-1.500，P=0.172)；A组的传代时间为(7.8±0.8)d，短于B组的(11.6±1.1)d(t=-6.008，P<0.001)。提示应用在37℃环境温度下FN包被的培养瓶行原代细胞培养，细胞贴壁速度及增殖速度都明显增快。(2)CDCs重悬培养时应用不同条件下FN包被的培养瓶，C组的细胞贴壁时间为(1.2±0.4)d，短于D组的(2.2±0.4)d，(t=-3.536 ，P<0.001)； C组的传代时间为(6.8±0.8)d，短于B组的(9.4±1.1)d(t=-4.111，P=0.003)。提示应用37℃环境温度下FN包被的培养瓶行CDCs重悬后细胞培养，细胞贴壁速度及增殖速度亦都明显增快。

2.4 各组细胞倍增水平 细胞倍增水平呈C组>A组>D组>B组，见图5。

图5 各组细胞间细胞倍增水平比较

3 讨 论

CSC是从心肌组织中分离提取的一种具有再生功能的干细胞，它的发现改变了“心肌细胞不可再生”的定论。但在人的一生中再生的心肌细胞数量极少，年轻人每年更新的心肌细胞数为1%，老年人为每年0.45%[7]，这可能与CSC的生存环境相关，对CSC进行深入研究并促进其迁移和再生对心脏疾病有着重大的意义。但由于CSC数量极少，而且生存于心肌组织内的干细胞巢内，分离培养原代CSC仍是一个难题。既往的实验方法耗时耗力、造价昂贵，本研究旨在应用更简洁更经济的方法分离培养CSC，为今后的实验做基础。

FN是高相对分子质量的黏附性的糖蛋白，含糖约5%，以二聚体或多聚体的形态存在。每个FN亚基上有与胶原、细胞表面受体、血纤蛋白和硫酸蛋白多糖高亲和结合的位点。FN具有多种生物学功能，其中一项是促进细胞的粘连生长，而细胞的粘连是细胞生长完成的必要条件。因此，FN是细胞培养时需要的重要试剂之一。有研究表明CSC的存活以及生物学功能与FN密切相关[8-13]。FN一级氨基酸序列的特点是高度保守性，含有大量重复序列，不同FN之间差异主要集中在3个可变区域。其中每个重复结构可能都是一个功能单位，重复序列包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。FN的一个重要功能区细胞结合区主要由Ⅲ型序列组成。已有研究证明FN的部分区域为温度敏感区，亦说明FN的变构与温度相关[14-16]。本研究通过改变FN孵育时的温度以增加CSC的贴壁率，从而提高培养效果。结果显示，应用在37℃环境温度下FN包被的培养瓶行原代细胞培养(A组)及CDCs重悬后细胞培养(C组)，细胞贴壁速度及增殖速度都明显增快(P<0.05)；此外，细胞倍增水平呈C组>A组>D组>B组，相同培养天数时的细胞倍增水平能够反映细胞的生长速度，细胞传代时间越短或(和)细胞倍增水平越大则细胞生长速度越快。这表明37℃孵育后的FN能显著促进CSC贴壁，其可能机制之一为37℃下FN构型使得其细胞结合区多肽更易于与细胞结合以促进细胞粘连贴壁生长。其次，免疫反应以及抗原抗体之间的结合受到温度，时间等因素的影响。在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。而37℃往往为抗原抗体作用的最适宜温度。因此本研究结果亦可能与37℃时FN与细胞结合增加有关。其具体机制还需要进一步实验以证明。

目前，磁珠分选的方法是一种比较常用的CSC分离培养的方法，但这种方法昂贵且所得细胞数少细胞质量不高，本研究中应用细胞贴壁传代及心肌球提取方法获得了大量较纯的CSC，证明本研究应用的实验方法简单易行价格经济效果优良，可为广大研究者采用。

CSC提取方法较其他原代细胞提取方法复杂，影响因素多，因此优化实验方法对实验结果意义显著，除了本研究中改变FN孵育的温度条件外，改变CSC的分离方法，摸索更适宜的培养基配方等都不失为一种可选择的方法，但其有效性和可行性还需进一步实验以证明。

[1] Hsieh PC,Segers VF,Davis ME,et al.Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury[J].Nat Med,2007,13(8):970-974.

[2] Porrello ER,Mahmoud Al,Simpson E,et al.Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart[J].Science,2011,331(6 020):1 078-1 080.

[3] Beltramr AP,Barlucchi L,Torella D,et al.Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration[J].Cell,2003,114(6):763-776.

[4] 贾竹青,周春燕.心脏干/祖细胞与心肌损伤修复[J].中国生物化学与分子生物学报,2011,27(10):889-893.

[5] Li TS,Cheng K,Malliaras K,et al.Direct comparison of different stem cell types and subpopulations reveals superior paracrine potency and myocardial repair efficacy with cardiosphere-derived cells[J].J Am Coll Cardiol,2012,59(10):942-953.

[6] Oskouei BN,Lamirault G,Joseph C,et al.Increased potency of cardiac stem cells compared with bone marrow mesenchymal stem cells in cardiac repair[J].Stem Cells Transl Med,2012,1(2):116-124.

[7] Bergmann O,Bhardwaj RD,Bernard S,et al.Evidence for cardiomyocyte renewal in humans[J].Science,2009,324(5 923):98-102.

[8] Ieda M,Tsuchihashi T,Ivey KN,et al.Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling[J].Dev Cell,2009,16(2):233-244.

[9] Knowlton AA,Connelly CM,Romo GM,et al.Rapid expression of fibronectin in the rabbit heart after myocardial infarction with and without reperfusion[J].J Clin Invest,1992,89(4):1 060-1 068.

[10]Leiss M,Beckmann K,Girós A,et al.The role of integrin binding sites in fibronectin matrix assembly in vivo[J].Curr Opin Cell Biol,2008,20(5):502-507.

[11]Leri A,Kajstura J,Anversa P.Role of cardiac stem cells in cardiac pathophysiology:a paradigm shift in human myocardial biology[J].Circ Res,2011,109(8):941-961.

[12]Bax NA,van Marion MH,Shah B,et al.Matrix production and remodeling capacity of cardiomyocyte progenitor cells during in vitro differentiation[J].J Mol Cell Cardiol,2012,53(4):497-508.

[13]Konstandin MH,Toko H,Gastelum GM,et al.Fibronectin is essential for reparative cardiac progenitor cell response following myocardial infarction[J].Circ Res,2013,113(2):115-125.

[14]Litvinovich SV,Strickland DK,Medved LV,et al.Domain structure and interactions of the type Ⅰ and type Ⅱ modules in the gelatin-binding region of fibronectin.All six modules are independently folded[J].J Mol Biol,1991,217(3):563-575.

[15]Turner PM,Lorand L.Complexation of fibronectin with tissue transglutaminase[J].Biochemistry,1989,28(2):628-635.

[16]Chernousov MA,Fogerty FJ,Koteliansky VE,et al.Role of the Ⅰ-9 and Ⅲ-1 modules of fibronectin in formation of an extracellular fibronectin matrix[J].J Biol Chem,1991,266(17):10 851-10 858.

Study on method for isolation and culture of rat cardiac stem cell in vitro

LIXue-yuan1,ZHANGYang2,TIANWen3,SUNYing-xian1,ZHANGGuang-wei4,JIANGDa-qing4

(1DepartmentofCardiology,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;2DepartmentofHandSurgery,AffiliatedCentralHospitalofShenyangMedicalCollege,Shenyang110000,China;3DepartmentofCadresDiagnosisandTreatment;4DepartmentOfCardiacSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Objective To compare the efficacies of fibronectin(FN) under different temperatures on isolation and culture of rat cardiac stem cell(CSC),thereby to screen the optimum method for isolation and culture of rat CSC in vitro.Methods The hearts of healthy newborn Wistar rats were removed under aseptic condition.And the heart tissues were digested by trypsin and collagenase Ⅱ separately and repeatedly,and then were cultured in cell culture flasks coated by FN.Cell surface antigen identification was performed in the CSCs of the third generation by immunohistochemistry.The primary cells cultured by FN coating under 37℃ and room temperature(22℃-25℃) were taken as Group A and Group B respectively.The CSCs cultured by FN coating under 37℃ and room temperature(22℃-25℃) were taken as Group C and Group D respectively.The time for cellular adherence,the first generation time and cellular multiplication level were compared between Group A and Group B,as well as Group C and Group D.Results CSCs were separated from heart tissues of newborn rats successfully,and the positive rate of cell surface antigen c-kit was 83%.The time for cellular adherence and the first generation time in Group A were shorted than those in Group B,and the times in Group C were also shorter than those in Group D(P<0.05).The cellular multiplication levels decreased in the order of Group C,Group A,Group D and Group B.Conclusion The efficacy of culture flasks coated by FN under 37℃ is superior in the isolation and culture of rat CSCs. 【Key words】 Cardiac stem cell,Cell isolation,Cell culture,Rat

辽宁省教育厅科技一般项目(L2013316)；中国医科大学附属第一医院科研资助(fsfh1311)

李学渊(1980～)，女，博士，主治医师，研究方向：冠心病的干细胞治疗。

R 331

A

0253-4304(2016)02-0160-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.04

2015-09-11

2015-12-31)