李文川 浦 涧

(1 右江民族医学院研究生学院，百色市 533000，E-mail：361666122@qq.com；2 右江民族医学院附属医院肝胆外科，百色市 533000)

综 述

肝细胞热缺血及再灌注损伤的机制研究现状▲

李文川1浦 涧2

(1 右江民族医学院研究生学院，百色市 533000，E-mail：361666122@qq.com；2 右江民族医学院附属医院肝胆外科，百色市 533000)

肝细胞热缺血及再灌注损伤(WIRI)是肝脏手术或肝移植中常见的病理生理变化，其显著影响患者术后恢复。WIRI的机制仍未完全明确，并且缺乏有效的预防和治疗策略。多种因素和途径参与WIRI过程，如氧化应激、Kupffer细胞活化、CD4+T细胞激活、细胞因子激活、中性粒细胞聚积和激活，最终可导致肝细胞损伤、凋亡和坏死、再生减少。本文对肝细胞WIRI的机制及其研究现状进行综述。

热缺血及再灌注损伤；肝细胞；发生机制；细胞死亡；细胞再生；综述

肝细胞热缺血及再灌注损伤(warm ischemia-reperfusion injury，WIRI)是肝脏手术和肝移植的常见障碍，其可影响肝脏术后余肝再生、供肝活力及肝功能恢复。肝移植已被公认为是一种有效治疗终末期肝病的方法以及标准肝癌的外科治疗选择[1]。随着移植的技术进步及免疫抑制治疗方案的改善，肝移植逐年递增，移植器官严重短缺，而导致越来越多地使用无心跳“边缘”供体，WIRI不可避免地成为移植术后原发性无功能和原发性移植物延迟功能的主要危险因素[2]。临床上，热缺血及再灌注引起的损伤程度直接影响肝脏手术和肝移植患者的总体情况，增加术后并发症的发生率和死亡率；此外，也影响失血性休克及感染性休克患者的抢救成功率。因此，了解WIRI的机制，有助于临床上预防和减少WIRI。现对肝细胞WIRI的机制及其研究现状进行综述。

1 缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，IR)引起WIRI发生的机制

WIRI是在肝脏手术肝移植、失血性休克及感染性休克等情况中常见的病理生理变化，可引起组织、器官功能障碍和衰竭。既往研究发现，肝细胞在WIRI中较为敏感，而肝窦内皮细胞在冷缺血及再灌注损伤中较敏感[3]。肝细胞WIRI是复杂且动态的病理生理过程，其发生机制主要涉及氧化应激、Kupffer细胞(Kupper cell，KC)活化、CD4+T细胞激活、细胞因子激活、中性粒细胞累积和激活，最终导致肝细胞损伤、凋亡和坏死、再生减少。

1.1 氧化应激作用 肝脏作为高能量需求的器官，高度依赖于供氧并且易受低氧或缺氧条件的影响[4]。热缺血时，肝细胞内外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)耗竭，导致ATP降解产物增加；再灌注复氧后，产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)。肝细胞WIRI时ROS生成增多的主要机制[5]：(1)热缺血-再灌注时，黄嘌呤脱氢酶转换成黄嘌呤氧化酶，释放出大量电子，O2接受后使ROS大量增多。(2)在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶的催化下，O2接受电子形成氧自由基，这个过程称为氧爆发或呼吸爆发。(3)线粒体氧化磷酸化功能障碍，电子传递链解耦联，形成的氧自由基增多。ROS直接损伤组织并激活有害细胞级联应答，导致炎症、细胞死亡、功能障碍[6]。氧化应激过程中ROS的产生也可充当信号分子介导细胞内的信号转导途径[7]。氧化应激通过多种机制损伤肝细胞，包括脂质过氧化、DNA损伤和酶变性[8-9]。在WIRI早期阶段，氧化应激作用引起损害发生并激活炎症通路，导致中性粒细胞聚积在后期阶段[10]。

1.2 KC活化作用 KC是肝脏血窦内最大的定居巨噬细胞群，参与了肝脏对感染、毒素、局部缺血、切除术及其他应激的反应[11]，并且是涉及WIRI最早阶段的关键细胞类型。脉管系统中KC的激活导致ROS的生成，从而引起氧化应激[12]。同时KC活化也释放细胞因子和趋化因子，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-12等，后者通过多种机制介导肝脏本身和远程器官的损伤；上调促炎性细胞因子、趋化因子和黏附因子，导致中性粒细胞在肝脏聚集，引起肝细胞WIRI进一步加重。此外，补体系统参与KC诱导氧化应激，促进ROS产生的启动和中性粒细胞在再灌注期间累积[13-14]。Giakoustidis等[15]的实验研究表明，应用抑制剂氯化钆阻断KC的活化作用可减轻肝脏WIRI。

1.3 CD4+T细胞的招募和激活作用 在再灌注早期阶段，肝脏WIRI中的CD4+T细胞被激活并招募到肝血窦，具有双重作用，是否有助于损伤或减少损伤程度，取决于细胞活化的CD4+亚型和机制。IL-1和TNF-α招募并激活CD4+T淋巴细胞，其产生TNF-β、TNF-γ、干扰素-γ(interferon gamma，INF-γ)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。这些细胞因子增强KC的活化，分泌TNF-α和IL-1，促进中性粒细胞募集并黏附到肝血窦，从而在激活过程中产生某些循环模式[16]。Lu等[17]发现在70%肝热缺血再灌注模型中，再灌注24 h后行调节性T细胞(Treg细胞)治疗显著降低血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶，并使INF-γ和IL-17表达显著下降，表明Treg细胞具有通过阻止炎性细胞因子的释放，改善肝脏WIRI的生化作用。Li等[18]的研究发现诱导性调节T细胞可诱发T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子4的阻断作用，有效改善WIRI。

1.4 细胞因子激活作用 多种细胞因子参与WIRI的病理生理过程，如炎症介质TNF-α、IL-1、IL-6、血小板活化因子和细胞间黏附分子-1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)以及补体等。这些细胞因子通过多种途径对肝细胞产生损伤。细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子可能是链接WIRI早期阶段的KC活化和晚期阶段由中性粒细胞介导WIRI的关键因素[19]。在IR损伤中，通过膜攻击复合物(C5b-C9)的形成沉积作用激活补体可直接或间接地活化细胞因子和趋化因子[20]。TNF-α是WIRI中最为重要的因子，它可导致血管内皮细胞的黏附分子表达，并刺激趋化因子，引起中性粒细胞的募集而释放出更多的活性氧和蛋白酶，产生进一步的损伤[21]。此外，TNF-α也可刺激KC产生更多的TNF-α。但TNF-α诱导肝细胞损伤的潜在机制尚未完全明确。TNF-α可能对线粒体产生的直接毒性，造成细胞坏死或细胞凋亡。同时，有研究发现中断TNF-α的释放可减轻肝损伤和增加肝再生[22]。IL-1可通过上调中性粒细胞促进ROS产生，进而加重损害。IL-1还可促使TNF-α产生，而TNF-α亦会引起IL-1释放。WIRI期间，IL-6释放也参与损伤过程。Camargo等[23]发现延迟释放IL-6对大鼠WIRI有保护作用。

1.5 中性粒细胞聚积和激活作用 肝脏WIRI后期阶段主要是炎性作用失调诱导中性粒细胞聚积。中性粒细胞激活参与WIRI相关联的肝微血管功能障碍和实质损伤[24]。中性粒细胞引发和活化ROS形成的过程，涉及补体因子、损伤相关分子模式和DNA片段，促使ROS启动增强[25]。趋化因子通过肝组织内趋化因子梯度作用，在缺血损伤区有助于吸引中性粒细胞；而中性粒细胞所需要的黏附分子如ICAM-1、整合素等，通过细胞-细胞间相互作用从血流转移到损伤区上[6]。炎性细胞和黏附分子在WIRI后期阶段占主导地位，可募集并激活中性粒细胞，其接触和黏附到内皮细胞，跨内皮移动，随后附着并损伤实质细胞[19]。中性粒细胞激活和聚积在WIRI中的作用有：(1)中性粒细胞通过颗粒胞吐作用释放蛋白酶和其他细胞酶，这些酶能降解细胞膜和基质成分。抑制中性粒细胞弹性蛋白酶，可破坏细胞外基质，降低肝损伤[26]。(2)中性粒细胞激活后可显著促进ROS释放到肝实质中，通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶依赖途径产生ROS引起肝实质损伤，并通过固有抗蛋白酶失活促进蛋白酶介导的损伤。(3)中性粒细胞和血小板黏附于内皮细胞，通过选择素家族介导导致血小板黏附和肝损伤。Junnarkar等[27]实验研究发现，使用布西拉明抑制中性粒细胞激活和调节B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白/B淋巴细胞瘤-2表达可减少肝细胞WIRI。

2 IR致WIRI中肝细胞死亡的机制

WIRI中肝细胞死亡主要机制是细胞凋亡和肿胀坏死[28]。凋亡细胞的标志包括染色质凝聚和核碎裂、细胞皱缩及凋亡小体形成。而坏死细胞的特征是细胞膜的完整性和细胞结构的破坏、空泡化和线粒体肿胀。目前对于WIRI中肝细胞主要死亡形式存有争论[29]，但细胞坏死是一种能量依赖的过程，理论上当ATP耗竭较大时，坏死应该占主导地位。

WIRI经由许多不同的途径引起细胞死亡，主要包括：(1)线粒体功能障碍：在线粒体内膜的非选择性通透性转换孔改变导致氧化磷酸化解耦联，引起膜去极化，导致细胞凋亡或坏死。(2)细胞内ATP水平降低：肝细胞缺血缺氧可刺激线粒体通透性转换(mitochondrial permeability transition，MPT)，线粒体膜电位崩塌，导致ATP合成失败，释放细胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)和凋亡诱导因子等。(3)活性氧机制：损伤的线粒体逐渐产生大量的ROS，同时ROS逐渐增多也可损坏同一线粒体，从而使ATP产生减少和细胞功能损害的可能性增大。除了高ROS产生系统，肝脏中抗氧化剂(如谷胱甘肽)和超氧化物歧化酶呈现低水平状态，进一步加剧ROS产生的有害影响。(4)细胞内钙超载机制：细胞内钙水平受缺血状态影响，细胞内钙离子增加可导致细胞凋亡。ATP迅速耗竭，细胞内钙水平增加，在肝细胞线粒体通透性转换孔中激活许多蛋白激酶，也可以激活线粒体外的信号加剧坏死途径。(5)凋亡基因作用：MPT使线粒体破裂，释放许多促凋亡蛋白进入细胞质，诱导Cyt-C和凋亡诱导因子，快速启动细胞凋亡级联。此外，再灌注期间TNF-α、IL-6和其他介质也可激活许多蛋白质，如蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸(caspase)-3和caspase-8以及线粒体Cyt-C等释放到细胞质中，参与肝细胞凋亡。Ye等[30]应用不同剂量富含甲烷的盐水处理大鼠热缺血再灌注模型，结果显示甲烷的抗凋亡、抗炎及抗氧化作用可减弱WIRI。

3 IR影响WIRI中肝细胞再生的机制

通常情况下，肝细胞保持一个阶段的沉寂(被称为G0期)，在适当的刺激时具有独特的增殖能力。肝脏再生的分子基础由启动阶段、增殖阶段和终止阶段3个阶段组成。这些阶段的发生涉及生长因子、细胞因子和其他介质高度协调和同步模式的相互作用[31]。生长因子如IL-6、TNF-α、表皮生长因子和肝细胞生长因子，转录因子如信号转导子和转录激活子-3、转录因子活化蛋白-1和核转录因子-κB，立即早期基因如原癌基因(c-fos、c-myc)和细胞周期蛋白，均是WIRI中肝细胞修复和再生的标志物。WIRI引起细胞因子、转录因子和立即早期基因上调增强，导致更为显著的肝细胞复制反应[32]。根据损伤的严重程度，WIRI对肝细胞再生的影响有两个方面：(1)一定程度的损伤可刺激肝再生的标志物，启动肝再生级联活动途径，增强肝细胞再生能力，促进损伤后肝组织的修复；(2)损伤程度较大、余肝体积较小、余肝质量较差，均可引起余肝再生能力下降，抑制损伤后肝组织的修复。Kato等[33]的实验研究表明，基质金属蛋白酶-9活性通过血小板内皮细胞黏附分子-1依赖性机制破坏血管完整性，并妨碍肝再生。

4 小 结

肝细胞WIRI是器官移植和其他临床疾病中涉及多因素、多途径相互作用的多方面且复杂的病理生理过程。近年来，研究者对WIRI引起肝细胞损伤的发生机制的认识显著提高，也提出了许多的潜在治疗方案，并在采用外科手术干预、缺血前后预处理、药物制剂和基因治疗等手段来预防和减少肝细胞WIRI等方面取得一定成果，但在临床应用上仍然存在一些缺陷和问题。因此，应采用新的方法进一步研究肝细胞WIRI的发生机制及基因组特征，为临床制定有效的预防和治疗策略提供依据，是下一步研究的内容和方向。

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广西研究生教育创新计划项目(YCSZ2015225)

李文川(1991～)，男，硕士研究生，研究方向：普通外科肿瘤病因与基础研究。

浦涧(1965～)，男，博士，教授，研究方向：普通外科肿瘤病因与基础研究，E-mail：pujianym@163.com。

R 657.3

A

0253-4304(2016)02-0233-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.25

2015-10-02

2016-01-08)