刘秀颖 吴 原 蓝瑞芳

(1 广西钦州市第一人民医院神经内科，钦州市 535000，E-mail：13471716560@163.com；2 广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁市 530021)

白藜芦醇对难治性癫痫细胞模型神经元损伤及神经突起的影响

刘秀颖1吴 原2蓝瑞芳1

(1 广西钦州市第一人民医院神经内科，钦州市 535000，E-mail：13471716560@163.com；2 广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁市 530021)

目的 探讨白藜芦醇(Res)对难治性癫痫细胞模型的神经元损伤及神经突起形态学变化的影响。方法 将体外培养至第10天的大鼠乳鼠海马神经元分为对照组、模型组、10 μmol/L Res组、20 μmol/L Res组、40 μmol/L Res组及60 μmol/L Res组。对照组采用正常细胞的细胞外液培养3 h后恢复维持培养液，模型组采用无镁细胞外液培养3 h后恢复维持培养液，4个 Res组经无镁细胞外液培养3 h后加入相应浓度的Res培养液。检测建立模型后24 h各组细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)的活性，光学显微镜下观察各组神经元及神经突起的形态学变化。结果 与对照组相比，模型组及各浓度Res组的LDH活性显著增加(P<0.05)；与模型组相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L Res组LDH活性明显降低(P<0.05)，其中以40 μmol/L Res组最低；60 μmol /L Res组与模型细胞的LDH活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。经建立模型后24 h，光学显微镜下可见模型组神经突起之间相互迁移聚集，突起连接成“网格样”；40 μmol/L Res组出现少部分神经突起迁移靠近聚集，大部分的突起连接分布均匀。结论 Res能减少难治性癫痫细胞模型的神经元损伤，抑制异常神经突起连接的形成。

难治性癫痫；白黎芦醇；神经元；神经突起；细胞模型；大鼠

癫痫经药物治疗后可获长期缓解，但仍有20%～30%的患者不能得到有效控制，发展为难治性癫痫，即耐药性癫痫。难治性癫痫患者的癫痫症状长期反复发作，不仅使患者躯体受到损害，而且在一定程度上导致患者心理障碍及一系列的社会问题。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种天然多酚类，广泛存在于葡萄皮、虎杖等植物中。目前已有实验研究发现，Res有抗癫痫的作用及对癫痫发作后损伤的神经元有保护作用[1]，但由于其抗癫痫的机制仍未完全明确而制约了临床应用。本实验拟通过无镁液建立体外难治性癫痫细胞模型，观察Res对难治性癫痫细胞模型神经元损伤及神经突起形态学变化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验药物 Res(纯度99%，批号PCS0043)购自北京中科仪友化工技术研究院。

1.2 实验动物 新生24 h内SD大鼠乳鼠12只，无特定病原体级，体重5～12 g，雌雄不限，购于广西医科大学实验中心，许可证号： SCXK(桂)2010-0002。

1.3 主要试剂 胎牛血清(Hyclone公司)、神经元基础培养基(Gibco公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、L-多聚赖氨酸 (Sigma公司)、B-27添加剂(Gibco公司)、神经微丝(Sigma公司)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)试剂盒(上海执诚)。主要溶液的配制：(1)种植培养液：90%的神经元基础培养基、10%胎牛血清、0.2 mol/L的L-谷氨酰胺、100 U/ml的青霉素及100 mg/L的链霉素。(2)维持培养液：98%的神经元基础培养基、2% B-27添加剂、0.2 mol/L的L-谷氨酰胺、100 U/ml的青霉素及100 mg/L的链霉素。(3)无镁细胞外液的配制：145 mmol/L氯化钠、2.5 mmol/L氯化钾、10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2 mmol/L氯化钙、10 mmol/L葡萄糖、0.002 mmol/L甘氨酸，将上述重量的粉末溶于1 000 ml的三蒸水，用NaOH将pH调至7.2，过滤灭菌后置于4℃冰箱待用。无镁细胞外液不含氯化镁成分，其余成分与细胞外液成分相同。

1.4 仪器设备 CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)，Zeiss Axiovert 200倒置相差荧光显微镜(德国Olympus公司)，SW-CJ-1F净化工作台(苏州净化集团安泰公司)。

1.5 方法

1.5.1 海马神经元的培养：实验前一晚将小盖玻片置于用培养基湿润过的12孔培养板，每个玻片小心滴加0.5 ml的多聚赖氨酸溶液，置于37℃、5% CO2培养箱过夜，用三蒸水清洗3遍后晾干备用。取SD大鼠，断头取脑，将大脑投入装有D-Hanks液的培养皿中(培养皿底下垫冰)，暴露双侧海马，钝性分离海马，置于另一个装有D-Hanks液的培养皿中(培养皿底下垫冰)，将海马组织剪碎为1 mm×1 mm×1 mm的小块。将剪碎的组织移入含有相当于5倍脑组织体积的0.125%浓度胰酶的离心管中，在37℃水浴箱中作用20～25 min，加入4 ml种植培养液终止消化，吸管轻轻吹打细胞约30次，1 000 r/min离心5 min，弃上清，在沉淀中再加适量种植培养液后，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，台盼蓝染色，血细胞计数板计数活细胞，根据计数结果，调整细胞终浓度为(1～2)×105个/ml，以此浓度接种于预先包被过的12孔培养板中，置于培养箱中培养。种板后10 h将培养液全量换成维持培养液，随后每3 d半量换液。

1.5.2 神经元的鉴定：采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)免疫细胞化学染色，以神经微丝蛋白单克隆抗体标记神经元。

1.5.3 神经元分组及难治性癫痫细胞模型的建立：将培养至第10天的海马神经元分为对照组、模型组及4个浓度的Res组，每组设6个平行孔。对照组更换为正常细胞的细胞外液培养3 h后恢复维持培养液。模型组为更换为无镁细胞外液培养3 h后恢复维持培养液，4个浓度的Res组经无镁细胞外液培养3 h后在每孔加入最终浓度为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L 的Res培养液，继续培养24 h。

1.5.4 分别取上述各组细胞建立模型24 h后的细胞培养液20 μl，按照LDH盒的说明，于全自动生化分析仪上测定LDH。

1.5.5 观察神经突起连接的形态学变化：倒置相差荧光显微镜下观察各组神经元及神经突起的变化。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，多组均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经元鉴定 利用神经微丝蛋白抗体鉴定，倒置显微镜下可见神经元胞浆内和轴突内棕黄色阳性颗粒，视野中可见大部分为神经元细胞，偶见非神经元细胞，表明所采用得培养方法获得的海马神经元纯度相对较高。见图1。

2.2 各组LDH活性的比较 与对照组相比，模型组及各浓度Res组的LDH活性显著增加(P<0.05)；与模型组相比，10 μmol/L Res组、20 μmol/L Res组、40 μmol/L Res组LDH的活性均有所减少(P<0.05)，其中40 μmol/L组达到最低；60 μmol/L组与模型组间LDH活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组的LDH活性比较(x±s，U/L)

注：与对照组比较，※P<0.05；与模型组比较，★P<0.05。

2.3 各组神经突起连接的形态学 模型组未经无镁液处理前，神经元光晕明显，神经元突起丰满，神经突起连接分布有序、均匀，见图2；无镁细胞外液处理3 h后，神经元形态及神经网络光镜下均未见明显变化；造模24 h后可见神经元胞体之间相互靠近，神经突起之间相互迁移聚集，突起连接成“网格样”变化，见图3。各Res浓度组细胞生长状态较模型组好，神经元突起仍大多丰满，仅出现少部分神经突起迁移靠近聚集，大部分的突起连接分布均匀，其中以40 μmol/L Res组最明显，见图4。对照组与无镁细胞外液处理前的模型组比较，细胞生长状态无明显变化。

图1 SD大鼠的海马神经元神经微丝蛋白免疫化学染色(×200)图2 无镁细胞外液处理前模型组的神经元突起及神经突起连接镜下情况(×200)图3 造模24h后模型组神经突起及神经突起连接的镜下情况(×200)图4 造模24h后40μmol/LRes组神经突起及神经突起连接的镜下情况(×200)

3 讨 论

通过体外培养海马神经元细胞，无镁液作用3 h后，可成为自发稳定放电癫痫细胞模型，该模型可作为难治性癫痫的细胞模型，已得到了很多研究者的认可[2-4]，目前广泛应用于抗癫痫新药的实验研究中[5-6]。Res存在于多种植物中，具有抗氧化、清除氧自由基、抗癫痫等多种生理活性。尤竹燕等[7]发现Res能抑制大鼠海马CA1区诱发癫痫样放电活动。有研究表明发现Res通过上调癫痫动物模型大鼠内海马内源性抗氧化酶，调控凋亡相关蛋白的表达，对抗癫痫发作发生的氧化损伤从而发挥神经保护作用[8]。但Res对难治性癫痫细胞模型的影响未见有报告。

LDH是广泛存在于神经元及神经胶质细胞中的氧化还原酶，正常情况下释放很少，细胞一旦受损，LDH即被释放到细胞外，且其水平与损伤程度呈正相关，可敏感反映细胞的活性。因此，通过测定LDH的量可以定量衡量细胞的损伤程度[9]。以往Res体内实验(包括了抗癫痫及缺血再灌注损伤模型)的给药范围为10～60 μmol/L[10-11]，本实验在此基础上，选择了10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L 4个剂量进行研究。结果显示，与对照组相比，模型组及各浓度Res组的LDH活性显著增加(P<0.05)，提示难治性癫痫模型大鼠的神经元损伤；与模型组相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L Res组的LDH活性均有所减少(P<0.05)，其中40 μmol/L Res组最低，表明Res能减轻难治性癫痫细胞模型神经元损伤，从病理生理学角度证明了Res对难治性癫痫细胞模型有确切的保护作用，其中以40 μmol/L Res组保护作用最强，提示Res的作用有一定的浓度依赖关系。但60 μmol/L Res组与模型组之间比较无显著性差异(P>0.05)，提示60 μmol/L的Res对难治性癫痫模型的细胞活性无明显影响，因此对于Res有效的药物浓度仍有待于进一步细致的研究。

难治性癫痫的发生机制与很多因素有关，目前神经网络学说正受到普遍关注，研究已证实反复的癫痫发作可导致脑组织尤其是海马结构的损伤，引起齿状回苔藓纤维侧枝发芽形成新的突触联系，最终形成异常的神经网络在难治性癫痫发病中有着重要意义[12-13]，促进了难治性癫痫的形成和反复发作。有动物模型研究发现，Res是通过抑制苔藓纤维发芽从而减少痫样放电的频率发挥抗癫痫的作用[14]。在本实验中，我们同样观察到了难治性癫痫细胞模型中存在神经突起连接的变化，表现为神经突起相互迁移聚集，突起连接成“网格样”变化，而Res干预组仅出现少部分神经突起迁移聚集，大部分的突起连接分布均匀。由此我们推测Res对难治性癫痫细胞模型异常网络的形成有一定抑制作用。

综上所述，Res能减少难治性癫痫细胞模型的神经元损伤，抑制异常神经突起连接的形成。

[1] Wang SJ,Bo QY,Zhao XH,et al.Resveratrol pre-treatment reduces early inflammatory responses induced by status epilepticus via mTOR signaling[J].Brain Res,2013,1492:122-129.

[2] Sombati S,Delorenzo RJ.Recurrent spontaneous seizure activity in hippocampal neuronal networks in culture[J].J Neurophysiol,1995,73(4):1 706-1 711.

[3] DeLorenzo RJ,Pal S,Sombati S.Prolonged action of the N-methy-D-aspartate receptor Ca2+transduction pathway causes spontaneous recurrent epileptiform discharge in hippocampal neurons in culture[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(24):14 482-14 487.

[4] 赵秀鹤,迟兆富,尚 伟,等.无镁诱导体外培养人胚海马神经元癫痫样放电的实验[J].中国病理生理杂志,2007,23(5):1 031-1 033.

[5] Deshpande LS,Nagarkatti N,Sombati S,et al.The novel antiepileptic drug carisbamate(RWJ 333369) is effective in inhibiting spontaneous recurrent seizure discharges and blocking sustained repetitive firing in cultured hippocampal neurons[J].Epilepsy Res,2008,79(2-3):158-165.

[6] Deshpande LS,Nagarkatti N,Ziobro JM,et al.Carisbamate prevents the development and expression of spontaneous recurrent epileptiform discharges and is neuroprotective in cultured hippocampal neurons[J].Epilepsia,2008,49(10):1 795-1 802.

[7] 尤竹燕,王斌生,解 敏,等.白藜芦醇对大鼠海马CA1区诱发癫痫样放电的影响[J].中国药理学通报,2012,28(2):260-265.

[8] 李燕玲,郭家智,钟莲梅,等.白藜芦醇调控癫痫持续状态大鼠大脑皮质内源性巯醇抗氧化剂(酶)的作用研究[J].神经解剖学杂志,2011,27(4):383-388.

[9] Schneemilch CE,Schilling T,Bank U.Effects of general anaesthesia on inflammation [J].Best Pract Res Clin Anaesthesiol,2004,18(3):493-507.

[10]赵 刚,王伟民,杨 帅,等.白黎芦醇对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国老年学杂志,2014,34(21):6 149-6 150.

[11]孟喜君,王 峰,李传坤.白藜芦醇对戊四氮致痫大鼠脑脊液、血清S100B蛋白的影响[J].中华神经外科疾病研究杂志,2013,12(4):318-321.

[12]Nadler JV.The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain[J].Neurochem Res,2003,28(11):1 649-1 658.

[13]Wu Y,Feng Y,Pang JR,et al.Study on expression of laminin in patients with intractable epilepsy[J].Int J Neurosci,2009,119(12):2 219-2 227.

[14]Wu Z,Xu Q,Zhang L,et al.Protective effect of resveratrol against kainite-induced temporal lobe epilepsy in rats[J].Neurochem Res,2009,34(8):1 393-1 400.

Effects of resveratrol on neuronal damage and neurite in cell model of intractable epilepsy

LIUXiu-ying1,WUYuan2,LANRui-fang1

(1DepartmentofNeurology,theFirstPeople′sHospitalofQinzhouCity,Qinzhou535000,China; 2DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the effects of resveratrol(Res) on the neuronal damage and morphologic change of neurite in cell model of intractable epilepsy.Methods On the 10th day of culture in vitro,the hippocampal neurons of neonatal rats were divided into control group,model group,10 μmol/L Res group,20 μmol/L Res group,40 μmol/L Res group and 60 μmol/L Res group.Control group and model group continued to be cultured with feeding medium after 3 hours of culturing with normal extracellular fluid and magnesium-free extracellular fluid respectively.Res culture medium with corresponding concentrations was added to the four Res groups after 3 hours of culturing with magnesium-free extracellular fluid.After 24 hours of modeling,the lactic dehydrogenase(LDH) activity of cell supernatant was detected in all groups,and the morphologic changes of neuron and neurite were observed in each group with optical microscope.Results Compared to control group,model group and four Res groups had significantly increased activities of LDH(P<0.05).The activities of LDH in 10 μmol/L Res group,20 μmol/L Res group and 40 μmol/L Res group decreased significantly compared to that in the model group(P<0.05),and the lowest activity was observed in 40 μmol/L Res group.But there was no statistical difference in the activity of LDH between 60 μmol/L Res group and model group(P>0.05).After 24 hours of modeling,the observation under optical microscope showed that neurites migrated closely to each other and connected to be grid-shaped in the model group,but a few neurites migrated closely to each other and most of neurites connections uniformly distributed in 40μmol/L Res group.Conclusion Res can reduce the neuronal damage in the cell model of intractable epilepsy,and can inhibit the formation of abnormal neurite connections.

Intractable epilepsy,Resveratrol,Neuron,Neurite,Cell model,Rat

刘秀颖(1983～)，女，硕士，主治医师，研究方向：癫痫。

R 74

A

0253-4304(2016)02-0164-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.05

2015-11-24

2016-01-25)