韩长志,任雪敏

(西南林业大学 林学院/云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224)

褐环乳牛肝菌中分泌蛋白的理化性质分析

韩长志,任雪敏

(西南林业大学 林学院/云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224)

为了更好地明确褐环乳牛肝菌分泌蛋白的功能，基于前期所获得327个分泌蛋白序列，对其理化性质进行分析。结果表明，69.72%的分泌蛋白理论等电点小于6.0，属于酸性蛋白，同时，利用随机数生成软件对上述不同理论等电点类别的分泌蛋白进行10%抽样分析，明确33个不同理论等电点类别的分泌蛋白(包括23个酸性蛋白、4个中性蛋白、6个碱性蛋白)的分子质量、分子式、原子数量、半衰期、不稳定性系数、脂肪族氨基酸指数、总平均亲水性等理化性质，其中14个分泌蛋白为稳定性蛋白，14个分泌蛋白为亲水性蛋白。

褐环乳牛肝菌； 分泌蛋白； 理论等电点； 理化性质

褐环乳牛肝菌(Suillusluteus)又名褐环粘盖牛肝菌，该菌不仅可以与松树、落叶松、云杉和冷杉等针叶植物形成外生菌根，为上述植物提供重要的磷元素供给，还可以为人们带来营养丰富的美味享受。目前该菌全基因组序列已经公布，国内学者从发酵条件[1-2]、培养条件[3]方面对其进行了大量研究，以及该菌对樟子松和油松苗的促生作用[4]、与木霉协同促进红皮云杉苗木抗逆增效作用等[5]研究，同时，还涉及过量钠盐、碱性pH值[6]和平菇汁[7]、接种量[8]对其生长的影响研究，以及pH值对其三羧酸循环、草酸分泌及代谢途径中关键酶活性的影响研究[9-10]等。此外，就国内诸多学者对该菌最适pH值的研究报道而言[2-3,6,8,11-15]，主要研究单位涉及西北农林科技大学、中国林业科学研究院、内蒙古农业大学等。通过对上述研究结果进行汇总分析，明确国内S.luteus的pH值在4.0～7.0，尤以5.5～6.0居多。作为针叶树种的重要外生菌根菌之一，在提高根系对磷元素和水分的吸收方面具有重要的作用[16]。然而，关于该菌为宿主植物提供磷元素的分子生态机制以及该菌分泌蛋白在磷元素代谢方面的作用研究尚未见报道。本研究基于前期所获得的327个分泌蛋白序列，同时结合前人对该菌最适酸碱度的研究成果，通过生物信息学分析方法解析该菌分泌蛋白的基本理化性质，以期为深入开展植物非致病菌中分泌蛋白影响寄主生长方面的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

前期利用SignalP、ProtComp、TMHMM、big-PI Fungal Predictor和TargetP等预测程序对S.luteus蛋白数据库中的18 303条序列进行分析预测，以该菌中含有的327个分泌蛋白为供试材料。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质理化性质预测 利用蛋白质数据库[17]在线分析预测分泌蛋白的等电点、分子质量及氨基酸组成等。

1.2.2 后续蛋白选择 利用随机数形成软件，对327个分泌蛋白中属于不同等电点类别的分泌蛋白进行10%的随机抽样选择，用于后续蛋白理化性质分析。

2 结果与分析

2.1 分泌蛋白的理论等电点预测

通过对327个分泌蛋白的理论等电点进行分析(图1)，发现最低值为3.33，最高值为10.76，以0.50为1个间隔单位，对上述分泌蛋白进行归类分析，结果表明，位于4.51～5.00的分泌蛋白数量最多，为73个，所占比例为23.32%；其次为位于4.01～4.50的分泌蛋白，数量为72个，所占比例为22.02%。理论等电点小于6.0的分泌蛋白有228个，所占比例高达69.72%，其次为理论等电点高于8.0的分泌蛋白有62个，所占比例为18.96%，而位于6.0～8.0的分泌蛋白所占比例仅为11.31%，数量为37个，上述结果表明，褐环乳牛肝菌中分泌蛋白大多属于酸性蛋白，该现象是否与其为松树等共生植物提供磷元素有关尚有待于进一步验证。

图1 褐环乳牛肝菌中327个分泌蛋白理论等电点的分布情况

2.2 部分分泌蛋白理化性质分析

从表1可以看出，在23个酸性蛋白中，有14个为假定蛋白(hypothetical protein)，所占比例为60.87%，其余8个为糖苷水解酶家族蛋白(glycoside hydrolase family)，1个为多铜氧化酶(multicopper oxidase)；4个中性蛋白预测功能均为假定蛋白；6个碱性蛋白中，5个预测功能为假定蛋白，所占比例为83.33%，1个为碳水化合物结合模块家族蛋白(carbohydrate-binding module family)。同时，就不同类型分泌蛋白所含有的正、负电荷氨基酸残基数而言，酸性蛋白中的负电荷氨基酸残基数均大于正电荷氨基酸残基数，而中性蛋白中的正、负电荷氨基酸残基数基本相同，碱性蛋白则与上述蛋白不同，为正电荷氨基酸残基数大于负电荷氨基酸残基数。

此外，对分泌蛋白的分子质量、分子式、原子数量、半衰期、不稳定性系数、脂肪族氨基酸指数、总平均亲水性等理化性质进行分析，结果表明，分子质量较大的蛋白质，其原子数量也多；而就所预测的不稳定系数而言，上述33个分泌蛋白中除GI号为750988325、750993542、751000725、751001439、750997409、751007593、751001188、751001671、750992882、751004198、751005465、750993505、750996377、750999030等14个蛋白质为稳定性蛋白外，其他均为不稳定性蛋白；就上述33个分泌蛋白的疏水性而言，14个蛋白质总平均亲水性小于0，属于亲水性蛋白，所占比例为42.42%(表2)。

表1 不同酸碱度分泌蛋白的基本信息

表2 部分分泌蛋白的理化性质

续表2 部分分泌蛋白的理化性质

3 结论与讨论

前人对植物病原卵菌、真菌甚至细菌的分泌蛋白均进行了相关预测以及分析，其中卵菌包括致病疫霉[18]、樟疫霉[19]，真菌包括酿酒酵母[20]、黄孢原毛平革菌[21]、禾谷镰刀菌[22]、粗糙脉孢菌[23]、稻瘟菌[24]、大丽轮枝菌[25]、米曲霉[26]、禾谷炭疽菌[27]等，细菌包括根癌土壤杆菌[28]、结核分枝杆菌[29]等。对于分泌蛋白在上述卵菌、真菌、细菌等不同种类植物病原菌中发挥的功能则不尽相同，所具有的作用机制也不尽相同。同时，就诸如褐环乳牛肝菌等对于寄主植物具有益生关系的外生菌根菌而言，其内分泌蛋白与上述植物病原菌中分泌蛋白所发挥的功能是否相同，作用机制相同与否均有待于进一步研究。

云南松(Pinusyunnanensis)作为我国西南地区尤其是云南省境内重要的建群树种以及荒山绿化造林先锋树种，其面积、蓄积量分别占云南省林地面积、蓄积量的29.2%和15.8%[30]。云南松林下外生菌根真菌资源十分丰富，现有27科39属211种可与其形成外生菌根[31]，包括红菇属(Russula)、牛肝菌属(Boletus)、乳菇属(Lactarius)、乳牛肝菌属(Suillus)等。然而，由于诸多外生菌根菌全基因组序列尚未公布，其分泌蛋白数量和种类也不清楚，对于分泌蛋白的功能研究报道更是非常少见。因此，关于外生菌根菌分泌蛋白参与供给磷元素的作用机制尚不够明晰，以及不同外生菌根菌供给磷元素的作用通路是否一致也不得而知。

外生菌根真菌往往喜欢偏酸性的环境，最适pH值一般在4.0～6.0[32]，同时，外生菌根菌还可以产生有机酸来改变环境的酸碱度[33]。本研究所获得的327个分泌蛋白，其中2/3分泌蛋白的理论等电点均小于6.0，外生菌根菌分泌蛋白的理论等电点范围与环境中最适酸碱度范围几乎一致，这有待于进一步验证。

本研究基于前期所获得的S.luteus中327个分泌蛋白序列，对其理化性质进行分析，同时，根据预测的理论等电点进行分类，明确69.72%的分泌蛋白属于酸性蛋白质。另外，通过随机选择10%的分泌蛋白进行理论性质分析，明确上述分泌蛋白的分子质量、分子式、原子数量、半衰期、不稳定性系数、脂肪族氨基酸指数、总平均亲水性等基本性质。该研究为进一步解析褐环乳牛肝菌中分泌蛋白影响针叶植物生长的分子机制提供了理论基础，也为外生菌根菌分泌蛋白发挥的功能解析提供了理论指导。

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Analysis on Physicochemical Property of Secreted Proteins fromSuillusluteus

HAN Changzhi,REN Xuemin

(College of Forestry,Southwest Forestry University/The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province,Kunming 650224,China)

To identify the function of secreted protein fromSuillusluteus,the physicochemical property of secreted protein were analyzed based on 327 secreted protein sequences.The results showed that the isoelectric point of 69.7% secreted proteins were less than 6.0,belonged to acidic protein,while 10 percent of these proteins were obtained by the random number producing software,and the physicochemical property of 33 secreted proteins including 23 acidic proteins,4 neutral proteins and 6 basic proteins with the different theoretical isoelectric point were analyzed including the molecular weight,atomic number,half-life,the instability factor,aliphatic amino acid index,total average hydrophilicity properties,and 14 proteins of which were stable protein,14 proteins were hydrophilic protein.

Suillusluteus; secreted protein; theoretical isoelectric point(PI); physicochemical property

2015-07-20

云南省高校优势特色重点学科(生态学)建设项目;中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室开放基金项目；西南林业大学大学生科技创新基金项目(C15037);云南省高校林下生物资源保护及利用科技创新团队项目(2014015)

韩长志(1981-)，男，河北石家庄人，讲师，博士，主要从事经济林木病害生物防治与真菌分子生物学的研究。 E-mail:hanchangzhi2010@163.com。任雪敏为并列第一作者。

Q939.96

A

1004-3268(2016)03-0125-05