杨立均，赵钰泽，王 静，周 祁，杨金淼，刘卫群*

(1.河南省烟草公司 驻马店市公司，河南 驻马店463000； 2.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002； 3.河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002)

烟草对烟草花叶病毒耐受性的早期防御反应

杨立均1，赵钰泽2，王 静3，周 祁2，杨金淼2，刘卫群2*

(1.河南省烟草公司 驻马店市公司，河南 驻马店463000； 2.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002； 3.河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002)

为深入研究植物对烟草花叶病毒(TMV)产生耐受性的机制，以烤烟栽培种NC89和其自然变异株系培育的品种豫烟8号(具有TMV耐受性)为材料，人工接种TMV后，检测其生理生化指标变化及抗性基因表达水平，并进行组织切片比较分析。结果显示，豫烟8号接种TMV 24 h叶片中的超氧阴离子含量、过氧化物酶(POD)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、过氧化氢酶(CAT)活性都明显高于NC89，而丙二醛(MDA)含量低于NC89，N基因表达水平高于NC89。接种TMV 9 d的烟草组织切片显示：相对豫烟8号，NC89叶片表皮细胞破裂，栅栏组织细胞间排列疏松，海绵组织细胞间隙较大。表明豫烟8号对TMV的耐受性体现在早期的快速应答反应。

烟草花叶病毒； 耐受性； 早期响应； 活性氧； 防御酶；N基因

烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是寄主范围非常广泛、传播能力强、危害严重的侵染性病原[1]，其防治相当困难。目前主要靠加强田间栽培管理和化学药剂进行防治[2]，但收效甚微，并且随着病毒抗药性的增加和人们对生态环境的重视，化学药剂防治的发展受到限制。科研工作者在基因工程策略和生物源农药防治等方面进行了大量的研究[3]，但至今实际应用效果不佳。由于病毒的增殖完全依赖寄主细胞内的物质和能源，要达到既不伤害寄主细胞，又能防止病毒的侵染或增殖，就必须解析病毒侵染后寄主的早期响应及其产生耐受性的调节机制，从而有针对性地设计防治措施。

抗病和感病植物的重要区别在于寄主植物对病原侵入识别的时间性和激发寄主植物防卫机制的速度和有效性，感病植物由于防卫反应慢且信号弱，最终导致病原的蔓延而使植物受到严重损害[4]。由病原菌侵染而引发防御反应的启动首先是产生大量的活性氧以及蛋白质的磷酸化，继而防卫相关基因表达、发生过敏反应(hypersensitive response，HR)，最后产生系统获得性抗性(systemic acquired resis-tance，SAR)等[5-6]。为深入研究植物对TMV 产生耐受性的分子机制，采用从TMV高发病的NC89烟田中筛选的无病健壮变异单株，经过选育几代而成的豫烟8号品种为对照材料，通过人工接种TMV，比较两品种对TMV侵染的早期响应及随后抗性基因表达水平，结合组织切片分析其对TMV耐受性的差异，为后期研究TMV侵染引起的植物代谢变化及植物的调节机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试剂和材料

TRIZOL试剂购自Invitrogen生物技术有限公司；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司(Takara)；其他常规试剂均为国产分析纯。供试材料豫烟8号和NC89由驻马店烟草公司提供。

1.2 病毒源提取、接种与取样

病毒源提取：取TMV毒源新鲜病叶，清水冲洗干净后用消毒滤纸吸干并去除主脉。根据取样质量加入40倍体积的磷酸缓冲液(0.05 mol/L，pH值7.0)，研磨后配制成40倍的病毒汁液，离心取上清液[3]备用。

接种病毒：选取移栽期50 d左右、长势一致的豫烟8号与NC89烟株，选择顶端新生叶下数第4片叶，表面均匀撒下石英砂，用棉签蘸取等量病毒汁液轻轻摩擦，来回重复3次。对照采用磷酸缓冲液按同样的方法进行处理。接种完成1 h后清水喷洗叶面，以利于植株发病[7-8]。

1.3 叶片组织石蜡切片分析

组织切片制作参照《植物显微技术》[9]。在DMBA450型MOTIC显微镜下观察并拍照保存。

1.4 粗酶液提取及酶活性测定

过氧化物酶(POD)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量的测定参照《植物生理生化实验原理和技术》[10]中的方法操作。

1.6N基因的表达模式分析

（5）加强国际协作，引领人工智能规范的国际治理。人工智能发展关系未来人类共同命运，加快国际合作，共同制定发展规范是大势所趋。除应重视技术发展外，还应加强与各国的合作，积极参与相关国际规范制定。当前，国际社会普遍关注网络安全和数据隐私，以及人工智能对社会伦理的影响，要主动加强在产业、智库、学者层面的沟通交流，主动引领命题，提供中国经验和中国解决方案。此外，中国的大市场为发展人工智能提供了很好平台，在保障国家安全的前提下，积极创造条件，推动国际合作，边应用、边治理，推进相关领域的国际立法。■

半定量分析和实时荧光定量PCR选用烟草Actin基因为内参基因，引物序列如下：上游引物为5′-GTTGGGCGTCCTCGTCA-3′，下游引物为5′-TGGGTCATCTTCTCCCTGTT-3′。N基因的特异性引物：上游引物为5′-ATGGGATTATTAGGCTTTCT-3′，下游引物为5′-AACCTCTGGTCCTTGTTTAT -3′，扩增片段为152 bp。总RNA提取参照TRIZOL试剂操作手册进行；cDNA第一链合成按照Takara公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit试剂盒说明书进行操作。实时荧光定量PCR在Biorad IQ5 荧光定量PCR仪上进行，结果分析采用 2-ΔΔCT法，其中,CT是循环阈值，ΔCT是目的基因与看家基因CT值的差值，ΔΔCT是不同时间处理与对照ΔCT值的差值。

2 结果与分析

2.1 接种TMV后活性氧含量的变化

2.2 接种TMV后防御酶活性和MDA含量的变化

从图2可以看出，接种TMV后两品种叶片中POD和 CAT酶活变化趋势相同，均在24 h达到峰值，随后酶活性开始下降，但豫烟8号叶片中的酶活性一直高于NC89。两品种MDA含量也迅速增加至第3天达到峰值。但豫烟8号叶片中MDA含量明显低于NC89，表明豫烟8号具有较强地维持细胞内活性氧平衡的能力，其遭受TMV伤害的程度小。

PAL是苯丙烷类代谢途径中的关键酶和限速酶，其能催化L-苯丙氨酸直接脱氨产生反式肉桂酸，在木质素和酚类物质的合成中起着重要的作用。因而苯丙烷类的代谢与植物抗病性有着密切关系，PAL会参与植物的抗病反应[13]。接种TMV后检测发现，两品种烟株叶片内的PAL活性均明显升高，至12 h达到峰值后酶活缓慢下降，但豫烟8号中PAL酶活下降速度明显低于NC89。以上结果进一步表明，豫烟8号对TMV侵染具有一定的耐受性。

烟草N基因是一个单显性抗TMV基因。为了进一步检测2个品种对TMV侵染的耐受性，采用半定量和定量PCR检测N基因的表达水平，结果表明(图3)，接种TMV后24 hN基因表达量最高，6 d表达量最低，豫烟8号整体表达水平比NC89高。

图2 接种TMV后POD、PAL、CAT活性和MDA含量变化

A为荧光定量PCR结果； B为半定量RT-PCR结果，0～4依次为NC89接种后0 h、12 h、24 h、6 d、9 d，5～9依次为豫烟8号接种后0 h、12 h、24 h、6 d、9 d图3 接种TMV后N基因表达变化

2.4 接种TMV后叶片组织结构变化

接种病毒后9 d上部叶片开始发病，下部叶少发病或不发病。心叶叶脉组织变浅绿色，对光看呈半透明状，以后蔓延至整个叶片形成“花叶”的典型症状：叶片局部组织叶绿素褪色，形成浓绿、浅绿相间。进行组织切片检测(图4)发现，TMV侵染9 d叶片组织结构与对照相比变化较大；NC89与豫烟8号相比，其叶片表皮细胞破裂，栅栏组织细胞间排列疏松，海绵组织细胞间隙较大。未接种的两品种间差异不明显。

1为未接种TMV的NC89(100倍)； 2为未接种TMV的豫烟8号(100倍)；3为接种TMV 9 d后的NC89(100倍)； 4为接种TMV 9 d后的豫烟8号(100倍)图4 接种TMV后叶片组织结构变化

3 结论与讨论

在植物与病原物漫长的协同进化过程中，植物逐步建立起多种多样的防御机制去抵御病原侵染[23]，其中最主要的是通过表达与抗病相关的基因来激活细胞内的防卫系统。N基因是烟草TMV抗性的标志基因[24]。本试验接种TMV后，豫烟8号N基因表达水平均高于NC89，从分子水平初步说明豫烟8号比NC89抗TMV。由于植物的抗病机制是一个复杂的信号网络过程，抗病性与体内相关基因在转录水平的表达调控及转录后蛋白质翻译加工水平的改变有密切的联系[25]。功能基因组学的发展，尤其是转录组、蛋白质组的研究，在探讨基因组在特定时期转录水平上的表达丰度及差异表达情况、大规模分析基因的表达模式等方面起着重要的作用，将有助于进一步深入揭示豫烟8号比NC89具有更强抗病能力的分子遗传基础。

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Early Defensive Reaction of Flue-cured Tobacco Tolerant to TMV

YANG Lijun1,ZHAO Yuze2,WANG Jing3,ZHOU Qi2,YANG Jinmiao2,LIU Weiqun2*

(1.Zhumadian Branch of Henan Province Tobacco Company,Zhumadian 463000,China; 2.College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

To further investigate the mechanism for tobacco mosaic virus(TMV) tolerance in plant,the physiological and biochemical indexes of flue-cured varieties NC89 and Yuyan 8,which was the natural variant cultivar from NC89 and acquired the tolerance to TMV,were detected after inoculation of TMV.The results showed that the content of superoxide anion,the enzyme activities of peroxidase(POD),phenylalanine ammonia lyase(PAL) and catalase(CAT) in Yuyan 8 were obviously higher than NC89,but the content of malondialdehyde (MDA) was lower than NC89 at 24 hours after inoculation with TMV.The expression level ofNgene in Yuyan 8 was higher than NC89.The tissue sections at 9 days post inoculation with TMV displayed that epidermal cells ruptured,the cell arrange of palisade tissue loosened,the porosity of spongy tissue increased in NC89 compared to Yuyan 8.The results suggested that the rapid response to TMV at early stage was the base for tolerance of Yuyan 8 to TMV.

TMV; tolerance; early response; reactive oxygen species; defense enzymes;Ngene

2015-08-19

驻马店市烟草公司科技计划项目

杨立均(1968-)，男，河南罗山人，农艺师，硕士，主要从事烟草生产和管理工作。E-mail：zmdylj@163.com

*通讯作者：刘卫群(1956-)，女，河北临城人，教授，博士，主要从事植物逆境分子生物学研究。 E-mail：liuweiqun2004@126.com

S435.72

A

1004-3268(2016)03-0082-05