李光哲　程　琳　陈　慧　元红花　许妍姬

(延边大学医学院预防医学教研室，吉林　延吉　133002)



淀粉样前体蛋白-C端片段对胚鼠原代皮层神经元cofilin磷酸化的影响

李光哲1程琳陈慧元红花许妍姬

(延边大学医学院预防医学教研室，吉林延吉133002)

摘要〔〕目的探讨淀粉样前体蛋白-C端游离片段(APP-CTFs)对ADF/cofilin的影响及作用机制。方法APP-CT99-pEGFP转染胎鼠原代皮层细胞，采用细胞免疫组化方法和蛋白印迹方法观察磷酸化cofilin和LIMK1的分布形态和表达水平。处理S3肽，LIMK1的特异性竞争性抑制剂后再观察磷酸化cofilin表达。结果细胞免疫组化实验结果，转染APP-CT99-pEGFP的细胞中，磷酸化cofilin和LIMK1在细胞质和细胞核中均有分布，与空载体转染组比较分布较高。S3肽处理后，磷酸化cofilin的表达水平减少。蛋白印迹实验结果，转染APP-CT99-pEGFP的细胞中，磷酸化cofilin和LIMK1蛋白水平增高，与空载体转染组比较具有显著性差异(P<0.05)。S3肽处理后，磷酸化cofilin蛋白水平降低。结论APP-CTFs通过LIMK1激酶调控cofilin磷酸化。

关键词〔〕淀粉样前体蛋白-C端片段；Cofilin；LIMK1；磷酸化

1延边脑科医院心理科

第一作者：李光哲(1973-)，男，博士，副主任医师，主要从事精神神经疾病的病因及药理学研究。

阿尔茨海默病(AD)有各种发病假说，其中淀粉样蛋白假说一直很受重视〔1〕。淀粉样前体蛋白(APP)是一种跨膜糖蛋白，先后经β-内切酶和γ-内切酶剪切之后，产生Aβ和不同长度的APP-C端游离片段(APP-CTFs)〔2～5〕。 AD脑组织除老年斑和神经元纤维缠结之外，还包含Hirano bodies，一种由肌动蛋白和其结合蛋白丝切蛋白(cofilin)构成的节状结构〔6～8〕。cofilin是存在于真核生物中的一种低分子量(21 kD)的肌动蛋白结合蛋白〔9〕。AD患者的脑皮质和海马回中发现的ADF/cofilin-肌动蛋白节状结构，在正常人脑中没有〔10〕。人单丝氨酸蛋白酶(LIMK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可直接磷酸化cofilin蛋白使其失活，从而逆转cofilin诱导的肌动蛋白解聚〔11，12〕。本研究欲探讨APP-CTFs对ADF/cofilin分子家族的影响及作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物及DNA孕17～18 d的SPF级SD大鼠，由延边大学动物实验中心提供。APP-CTFs由韩国首尔医科大学药理学教室徐维宪教授馈赠。

1.2药品与试剂胰蛋白酶(Sigma)；胎牛血清(Corning，N.Y，14831，USA)；马血清；N2；DMEM培养液(Grand Island，N.Y，14072，USA)；多聚赖氨酸；Triton X-100；甲醛；甲醇；淬灭剂封片液；磷酸化(ph)-cofilin和ph-LIMK单克隆抗体，相应的二抗、蛋白印迹封闭液、洗涤液、免疫组化固定液、洗涤液、封闭液均购自碧云天生物有限公司。S3肽，LIMK1的特异性竞争性抑制，其结构为MASGVAVSDGVIKVFNRQIKWFQNRRMKWKK，由上海科肽公司合成。

1.3实验仪器蛋白印迹电泳装置、恒温水浴锅、分析天平、CO2培养箱、脱式摇床；离心机、解剖体式显微镜、荧光显微镜、制冰机、立式压力蒸汽灭菌器、移液器等均由延边大学医学院预防医学实验中心提供。

1.4实验方法

1.4.1质粒的扩增、提取和纯化分别将含有重组质粒pEGFP-N1-APP-CTFs(C99，C57)〔5〕和空载体pEGFP-N1的菌种用Kan+培养基培养并选取单菌落，取单菌落至10 ml含Kan+的LB液体培养基中，于37℃、230 r/min振荡培养过夜，再转入200 ml LB液体培养基中扩大培养。按照质粒大量提取试剂盒说明提取、纯化质粒，并用紫外分光光度计测定质粒的浓度和纯度。

1.4.2细胞培养用乙醚麻醉怀孕18 d的SPF级SD大鼠，无菌条件下取胚胎，置于含冰冷的D-Hank液的平皿中，反复清洗，去除血渍。断头，分离大脑，剥离脑膜，取皮层，将皮层剪碎成1 mm×1 mm大小或更小，离心去上清。加0.25%的胰酶在37℃的水浴锅中孵育20 min。离心，去上清，用含5%的马血清、10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞沉淀，轻轻吹打20次，自然沉淀后上清即为原代皮层细胞。

将多聚赖氨酸用无菌的三蒸水配制成0.1%的溶液，每孔用1 ml多聚赖氨酸溶液包埋过夜，回收，晾干，用无菌三蒸水清洗3次，晾干，紫外照射。将获得的细胞接种于含5%的马血清、10%胎牛血清的DMEM培养液被多聚赖氨酸包埋的六孔板中，放置在5%CO2，37℃的CO2培养箱中。第2天换成含有1%N2的DMEM培养液中，隔1 d换成含有适合5%马血清、10%胎牛血清的DMEM培养液中。第5～7天做细胞处理。

1.4.3质粒的转染及在原代皮层神经元细胞中的表达实验分为三个组，①对照组转染pEGFP-N1空载体，②APP-CT99转染组，③APP-CT57转染组。转染过程按照Lipofectemin脂质体2000转染试剂说明进行。每组细胞均于24 h后在荧光显微镜下观察。

1.4.4蛋白印迹方法用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，加入RIPA裂解液，在冰上用细胞刮裂解细胞，收集细胞，4℃ 8 000 r/min离心5 min，得出细胞裂解液，蛋白定量，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用封闭液封闭1 h，用活化的ph-cofilin单克隆抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜，洗涤液漂洗3次后加二抗辣根过氧化酶(HRP)-IgG(1∶1 000)，室温孵育1 h，洗膜3次后化学发光法显色。用凝胶图像分析系统分析条带灰度值，tubulin作为内参照，得出蛋白质表达水平。

1.4.5免疫组化(IC)吸尽培养液，加1 ml固定液，固定10 min，弃去固定液，用洗涤液在脱式摇床上洗3次，每次5 min，吸尽液体。用封闭液封闭60 min，在摇床上轻轻摇动。去封闭液，用稀释的一抗ph-cofilin和ph-LIMK(1∶200)孵育60 min，摇床上轻轻摇动。回收一抗，用洗涤液洗3次，每次5 min，吸尽液体。加入1 ml稀释好的二抗避光孵育60 min，摇床上轻轻摇动。回收二抗，用洗涤液洗3次，每次5 min，吸尽液体。期间避光操作。

把盖玻片取出，盖在滴有淬灭剂封片液的载玻片上，尽量避免气泡，荧光显微镜下观察。

1.5统计学方法应用SPSS11.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1显微镜下观察细胞形态显微镜下观察到刚接种的皮层神经元细胞大多为圆形，2 h后见有少量的神经元细胞开始贴壁，细胞多为散在的单个细胞。培养第2天大多数的神经元细胞都已经贴壁。继续培养后神经元胞体渐渐增大，长出突起的神经元细胞越来越多，突起也开始变长。培养到第5天的神经元细胞胞体最饱满，细胞90%长满平皿，许多突起都交织成网，适合做处理。见图1。

图1　不同时间段显微镜观察大鼠皮层原代神经元生长状况(×10)

2.2转染APP-CTFs对ph-cofilin和ph-LIMK表达的影响共聚焦显微镜下观察，转染APP-CT99、CT57-pEGFP组与空载体对照组相比较，ph-cofilin和ph-LIMK蛋白表达水平明显增加(图2，图3)。蛋白印迹实验结果也证实了转染APP-CT99、57-pEGFP可诱导 cofilin磷酸化(0.633±0.05，0.621±0.025)和ph-LIMK表达水平(0.747±0.038，0.643±0.032)的增高，与对照组(0.365±0.045，0.438±0.028)相比较具有显著性差异(P<0.05)。见图4。

图2　APP-CTFs诱导cofilin的磷酸化免疫组化染色结果(×400)

2.3S3肽处理对APP-CTFs诱导ph-cofilin表达的影响蛋白印迹实验结果显示，转染APP-CT99、57-pEGFP的细胞经S3肽处理后，ph-cofilin的表达水平(0.374±0.028，0.348±0.019)减少，与不处理组(0.563±0.032，0.441±0.034)比较有显著性差异(P<0.05)。见图5。

图3　APP-CTFs诱导LIMK1磷酸化在原代皮层培养细胞中的表达(×400)

图4　APP-CTFs诱导cofilin磷酸化和LIMK1磷酸化

图5　S3肽抑制APP-CTFs诱导的cofilin磷酸化

3讨论

AD是一种严重危害人类健康的神经系统退行性疾病，其典型的病理特征有老年斑、神经纤维缠结、神经元的丢失、Tau过度磷酸化〔1〕。APP是一种跨膜糖蛋白，存在于多种细胞中，由21号染色体中的一个基因编码，N端位于细胞外，C端位于细胞内。APP先后经β-内切酶和γ-内切酶剪切之后，产生Aβ和不同长度的APP-C端游离片段，Aβ是老年斑的主要成分〔2～4〕。最近研究表明，异常的cofilin沉积可引起Tau神经毡螺纹，所以提示cofilin-肌动蛋白束在AD病理机制中可能发挥重要作用〔13〕。但cofilin-肌动蛋白节状结构形成的具体机制还未阐明。cofilin是肌动蛋白结合蛋白，参与细胞凋亡、胞质分裂及对鬼笔环肽的作用〔9〕；它能够精密控制肌动蛋白的动力并通过切割和解聚重组肌动蛋白丝。Ser3位点的磷酸化使cofilin蛋白失活，LIM激酶(LIMK)1是cofilin磷酸化酶中的一种，对Ser3位点具有高度亲和力。LIM激酶作为细胞骨架动力学的调节子，位于Rho-ROCK诱导的含肌动蛋白的细胞骨架的信号通路上，主要通过磷酸化cofilin蛋白来调节肌动蛋白丝和质膜结构的重新组装〔11，12〕。本文结果显示APP-CT99和C57均可增加磷酸化LIMK1的水平。β-APP内结构域(AICD)直接释放到细胞质内，可影响很多细胞内分子和信号系统。在前期的实验研究中已阐明APP-CTFs和APLP2-CTFs的毒性通路，被各种酶切之后形成的AICD与Fe65结合进行核转移，后与CP2/LSF/LBP1转录因子结合刺激GSK-3β基因，增强Tau磷酸化〔5，14〕。本次研究提示AICD通过作用于LIM激酶调控cofilin磷酸化，从而调控微丝的解聚，影响细胞骨架结构，提示了一个新的毒性通路。

参考文献4

1王爱霞，王瑞婷.淀粉样蛋白在阿尔茨海默病中的作用及机制研究〔J〕.承德医学院学报，2012；29(3)：306-9.

2Cao X，Sudhof TC.A transcriptionally active complex of APP with Fe65 and histone acetyltransferase Tip60〔J〕.Science,2001；293(5527)：115-20.

3Kimberly WT，Zheng JB，Guenette SY，etal.The intracellular domain of the beta-amyloid precursor protein is stabilized by Fe65 and translocates to the nucleus in a notch-like manner〔J〕.J Biol Chem，2001；276(43)：40288-92.

4Minopoli G，de Candia P，Bonetti A，etal.The beta-amyloid precursor protein functions as a cytosolic anchoring site that prevents Fe65 nuclear translocation〔J〕.J Biol Chem，2001；276(9)：6545-50.

5Kim HS，Kim EM，Lee JP，etal.C-terminal fragments of amyloid precursor protein exert neurotoxicity by inducing glycogen synthase kinase-3beta expression〔J〕.FASEB J,2003；17(13)：1951-3.

6Bamburg JR，Bernstein BW.Roles of ADF/cofilin in actin polymerization and beyond〔J〕.F1000 Biol Rep,2010;19(2)：62.

7Bamburg JR，Bloom GS.Cytoskeletal pathologies of Alzheimer disease〔J〕.Cell Motil Cytoskeleton,2009;6(8)：635-49.

8Davis RC，Marsden IT，Maloney MT，etal.Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin-phosphorylation〔J〕.Mol Neurodegener,2011;6(1)：10.

9赵微，苏玉虹,巴彩风，等.Cofilin蛋白功能及活性调节〔J〕.中国生物化学与分子生物学报,2007；23(9)：706-7.

10郭林林,李学宝，巴彩风.肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白：肌动蛋白重塑蛋白质家系〔J〕.生命的化学,2005;25(3)：216-8.

11Bamburg JR，Bernstein BW，Davis RC，etal.ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases〔J〕.Curr Alzheimer Res,2010；7(3)：241-50.

12Heredia L，Helguera P，de Olmos S，etal.Phosphorylation of actin-depolymerizing factor/cofilin by LIM-kinase mediates amyloid beta-induced degeneration：a potential mechanism of neuronal dystrophy in Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurosci,2006；26(24)：6533-42.

13Yao J，Hennessey T，Flynt A，etal.MicroRNA-related cofilin abnormality in Alzheimer′s disease〔J〕.PLoS One,2010；5(12)：e15546.

14Xu Y，Kim HS，Joo Y，etal.Intracellular domains of amyloid precursor-like protein2 interact with CP2 transcription factor in the nucleus and induce glycogen synthase kinase-3β expression〔J〕.Cell Death Differ,2007；14(1)：79-91.

〔2014-12-17修回〕

(编辑袁左鸣)

·基础研究·

The effect of C-terminal fragments of amyloid precursor protein on phosphorylation of cofilin in rat primary neuronal culture cells

LI Guang-Zhe, CHENG Lin, CHEN Hu，etal.

Department of Preventive Medicine,Medical College Yanbian University,Yanji 133002,Jilin, China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of C-terminal fragments of amyloid precursor protein on phosphorylation of cofilin in rat primary neuronal culture cells.MethodsAPP-CT99-pEGFP was transfected into fetal rat primary cortical neurons ,then the distributional pattern and protein expression levels of cofilin and LIMK1 were tested by immunofluorescence and Western blot. After the treatment with S3 peptide, the activities of LIMK1 and phosphorylated cofilin were measured.ResultsThe phosphorylated cofilin and LIMK1 were distributed in the cytoplasm and nuclei.Compared with that of empty vector transfection group,the protein distribution was higher,however, in S3 peptide treatment group, the expression of phosphorylated cofilin level was decreased. Transfection with APP- CT99-pEGFP into cells, the phosphorylated cofilin and LIMK1 protein expression levels were higher compared with those of empty vector transfection group(P<0.05).And the phosphorylated cofilin protein levels in S3 peptide treatment group were decreased as well.ConclusionsAPP-CTFs could regulate cofilin phosphorylation through the LIMK1.

【Key words】APP-CTFs；Cofilin；LIMK1；Phosphorylation

通讯作者：许妍姬(1973-)，女，博士，副教授，主要从事神经毒理学研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81160159)

中图分类号〔〕R74〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6641-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.001