赵　佳　李向楠　朱登彦　吴　恺　丁　政　盛银良　乔呈瑞　杨　洋　刘东雷　赵　松

(郑州大学第一附属医院胸外科，河南　郑州　450052)



拓扑替康对食管癌EC9706细胞自噬和凋亡的影响

赵佳李向楠朱登彦吴恺丁政盛银良乔呈瑞杨洋刘东雷赵松

(郑州大学第一附属医院胸外科，河南郑州450052)

摘要〔〕目的探讨拓扑替康(TPT)对食管鳞癌细胞株(EC9706)自噬和凋亡的影响。方法使用20 mg/L TPT和(或)5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理人食管鳞癌细胞EC9706，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测TPT对食管癌EC9706细胞生长的抑制作用，单丹磺酰尸胺(MDC)法检测TPT对EC9706细胞自噬水平的影响，采用流式细胞仪技术检测TPT对EC9706细胞凋亡的影响，Western 印迹测定TPT对EC9706细胞自噬相关蛋白Beclin1和凋亡相关蛋白Caspase-3表达的影响。结果流式细胞仪检测结果显示，TPT作用于EC9706细胞48 h后，TPT组、3-MA组及TPT+3-MA组细胞凋亡结率分别为(32.45±2.79)%、(7.58±1.12)%及(48.69±3.51)%。MDC染色结果显示TPT能够诱导细胞内自噬囊泡的出现，而3-MA能显著抑制这一现象。Western 印迹结果显示对照组、TPT组、3-MA组及TPT+3-MA组Beclin1和Caspase-3蛋白的相对灰度值分别为0.62±0.06、0.91±0.12、0.47±0.04、1.04±0.08和0.54±0.05、0.84±0.11、0.42±0.03、0.71±0.07。结论TPT康可以诱导食管鳞癌细胞自噬和凋亡的发生，而3-MA能够通过抑制自噬上调Caspase-3的表达增强对食管癌细胞的杀伤作用。

关键词〔〕拓扑替康；食管癌；凋亡；自噬

第一作者：赵佳(1982-)，男，主治医师，主要从事胸外科基础与临床研究。

拓扑替康(TPT)属于喜树碱类化合物，主要通过抑制拓扑异构酶I的活动，通过抑制DNA复制而起到抗癌的作用〔1〕，现多用于肺癌及晚期卵巢癌的化疗。研究表明TPT作为放疗增敏剂在肺癌、头颈部肿瘤及食管癌的治疗中有效〔2〕，但其对于食管鳞癌细胞的作用及其机制尚不完全清楚。本研究主要观察TPT对于体外培养的食管鳞癌细胞株(EC9706)细胞自噬和凋亡的影响，并进一步明确自噬和凋亡在其中所起的作用。

1材料与方法

1.1材料TPT康购自贵州汉方制药有限公司，人食管鳞癌细胞株EC9706由河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室赠送；3-甲基腺嘌呤(3-MA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、单丹磺酰尸胺(MDC)为美国Sigma公司产品。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化液购自美国Solarbio公司，AnnexinV-FITC/PI试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。Beclin1及Caspase-3多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2细胞培养与分组EC9706细胞置于含10%胎牛血清的1640培养基中，37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，2～ 3 d换液1次，取对数生长期细胞用于实验。将细胞分为空白对照组、TPT组(20 mg/L)、3-MA组(5 mmol/L)及联合应用组TPT(20 mg/L)+3-MA(5 mmol/L)组。

1.3MTT法检测细胞抑制率取对数生长期细胞，按每孔1×106/L细胞接种于96孔板，每孔加入100 μl细胞悬液培养24 h；分别加入一系列浓度的3-MA及TPT，每孔加入100 μl，对照组加入等体积培养液，放入37℃、5% CO2恒温培养箱中培养；48 h后每孔加入浓度为5 g/L的MTT 10 μl，继续于培养箱中孵育4 h，吸去培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100 μl，震荡10 min，用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度(A)值。细胞生长抑制率=〔1-实验组A490/对照组A490〕×100%。

1.4AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡取对数生长期细胞，以1×107/L的浓度接种于6孔板中，培养24 h待细胞贴壁后按实验分组分别加入相应浓度药物， 胰酶消化并离心收集细胞，冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后，按细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤操作，先加入AnnexinV-FITC染色液，4℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI， 立即上流式细胞仪检测。每组实验重复3次。MDC染色检测细胞自噬水平变化：取对数生长期细胞，以1×107/L接种于24孔板中，培养24 h待细胞贴壁后按实验分组分别加入相应浓度的TPT和(或)3-MA，同时设立阴性对照组，弃培养液，加入浓度为50 μmol/L的MDC在37℃下染色60 min，弃染液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用倒置荧光显微镜观察自噬空泡的变化情况并摄片。

1.5Western 印迹检测细胞Beclin1和Caspase-3蛋白的表达取对数生长期细胞，以1×106/孔细胞密度接种，待细胞贴壁后，按相应实验浓度加入相应药物，同时设立空白对照组。提取各组细胞总蛋白，使用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量，经聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后转膜，脱脂奶粉常温封闭1 h，分别加入Beclin1及Caspase-3抗体，4 ℃孵育过夜,后加入二抗，轻轻振摇2 h后洗二抗，并进行显影、定影、洗片。后将结果扫描后进行灰度值分析，以β-actin为内参照。

1.6统计学方法应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1MTT检测结果EC9706细胞的生长抑制率随着TPT和3-MA浓度的增加而逐渐增加。作用48 h后，TPT的IC50为20 mg/L，3-MA的IC10为5 mmol/L，因此将这两个浓度作为实验浓度。

2.2流式细胞仪检测细胞凋亡AnnexinV-FITC/PI法检测结果显示，空白对照组、3-MA组、TPT组及TPT+3-MA组细胞凋亡结率分别为(3.41±0.47)%、(7.58±1.12)%、(32.45±2.79)%、(48.69±3.51)%。与对照组相比，3-MA组明显高于空白对照组；与TPT组相比，TPT+3-MA组细胞凋亡率明显高于单用TPT组。

2.3MDC检测细胞自噬细胞内自噬空泡可被染成绿色点状结构。结果显示，与空白对照组相比，3-MA组细胞未见明显自噬空泡，单用TPT组细胞可见细胞中出现大量自噬空泡。与TPT组相比，3-MA+TPT组绿色荧光强度明显减少。

2.4Western 印迹检测细胞Beclin1和Caspase-3的表达与对照组相比，TPT组Caspase-3和Beclin1蛋白表达均明显增加；与TPT组相比，TPT与3-MA联合作用组Caspase-3蛋白明显增加，Beclin1蛋白表达有所减少，见表1。

表1　各组细胞中Beclin1和Caspase-3表达

与对照组相比:1)P<0.05；与TPT组相比:2)P<0.05

3讨论

食管癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，目前食管癌的治疗仍是以手术、放疗和化疗为主的联合治疗。尽管近年来化疗在局部晚期的食管癌治疗中起到越来越重要的作用，但其效果仍不令人满意。TPT主要通过抑制拓扑异构酶I的活性，使DNA单链断裂进而起到抑制肿瘤细胞生长的作用。已有研究显示，TPT康能够在多种人肿瘤细胞中起到放射增敏作用，如肺癌、黑色素瘤、鼻咽癌、食管癌等。本研究结果显示，TPT能够对体外生长的食管鳞癌EC9706细胞起到明显的杀伤作用，且这一作用呈时间-剂量依赖性。

细胞自噬是细胞内一种保守的蛋白降解通路，研究显示其与细胞生长发育、分化及死亡关系密切，并与包括肿瘤在内的多种疾病密切相关〔3〕。Beclin1是酵母ATG6的同系物，是反映细胞内自噬水平高低的标志性分子之一，在细胞内自噬溶酶体形成的过程中发挥重要作用〔4〕。在本研究中，MDC染色结果显示TPT能够在诱导EC9706细胞发生凋亡的同时亦导致细胞内自噬水平的增加，而自噬特异性抑制剂3-MA能够抑制自噬水平的提高。

为了进一步明确自噬和凋亡在TPT对EC9706细胞抑制过程中的作用，我们将自噬特异性抑制剂3-MA与TPT联合应用，结果显示3-MA能够增加TPT对EC9706细胞的杀伤作用，MDC染色及Western 印迹结果提示这一作用可能与3-MA抑制细胞内自噬水平有关。流式细胞仪检测结果提示，3-MA与TPT联合应用后细胞凋亡率明显升高，Western 印迹结果显示其机制可能与Caspase-3蛋白的激活有关。Caspase-3是Caspase家族中最重要的成员，大多数触发细胞凋亡的因素最终均需要Caspase-3介导的信号转导通路导致细胞凋亡〔5〕。本研究结果提示，在TPT诱导食管癌EC9706细胞发生凋亡的过程中，自噬可能起到保护作用，抑制自噬可能能够通过激活内源性凋亡通路而增加细胞凋亡。

综上所述，结合本研究结果认为TPT能够对人EC9706细胞的生长有明显的抑制作用，而联合自噬抑制剂有可能增加拓TPT的治疗效果，这些发现为下一步TPT的临床研究提供了实验依据。

参考文献4

1Chen AY,Chen PM,Chen YJ.DNA topoisomerase I drugs and radiotherapy for lung cancer〔J〕.J Thorac Dis，2012;4(4):390-7.

2Owonikoko TK,Aisner J,Wang XV,etal.E5501:phase Ⅱ study of topotecan sequenced with etoposide/cisplatin,and irinotecan/cisplatin sequenced with etoposide for extensive-stage small-cell lung cancer〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol，2014;73(1):171-80.

3潘丽红,赵松,党丽峰，等.自噬在蛋白酶体抑制剂诱导的食管鳞癌细胞死亡中的作用〔J〕.中华实验外科杂志，2013；30(11):2339-41.

4Deretic V,Saitoh T,Akira S.Autophagy in infection,inflammation and immunity〔J〕.Nat Rev Immunol，2013;13(10):722-37.

5Yamaguchi M.The anti-apoptotic effect of regucalcin is mediated through multisignaling pathways〔J〕.Apoptosis，2013;18(10):1145-53.

〔2015-09-10修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：赵松(1963-)，男，教授，主任医师，博士生导师，主要从事胸部肿瘤的基础及临床诊治研究。

中图分类号〔〕R735.1〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6061-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.024