孙文武 马壮



·综述·

呼吸系统雾化基因治疗研究进展

孙文武 马壮

呼吸系统疾病； 雾化治疗； 基因治疗

基因治疗作为新的分子治疗手段对人类疾病的治疗有重大影响，然而基因治疗的安全性和有效性是其应用于临床治疗的主要障碍[1]。呼吸系统的结构特点和生理功能使其内表面与外界环境充分接触，这样以雾化形式进行基因治疗为呼吸道疾病治疗提供了一种新的手段。这种雾化吸入性非侵入的转基因方式逐渐被重视起来，近20年在这一领域取得了一些成果，也遇到了一些有待解决的难点。现对呼吸系统雾化吸入基因治疗研究进展作一综述。

一、雾化设备

呼吸系统雾化转基因技术是在机体整体给药基础上发展而来，在呼吸系统基因雾化吸入转染研究之初，对动物整体给予载体修饰后的基因，观察在静脉和呼吸道气溶胶给药后肺部局部的基因表达情况，发现两种方法均可以在肺脏有基因表达，但经静脉方式多在动脉分岔部位的血管内皮细胞表达，而雾化吸入的基因表达多在肺呼吸道上皮细胞和肺巨噬细胞表达[2-3]。Gautam等[4]研究表明雾化吸入的方式给予的转基因方法只在肺局部有目的基因中表达，在机体其他部位没有表达。

为了使目的基因很好地与液体一起形成气溶胶，Lentz等[5]研究了多种雾化方法，主要包括：气体流动喷射雾化方式、超声波雾化方式、高频机械震动方式和静电射流方式等。气流喷射式雾化机是应用压缩后的空气，使气体通过溶液，使溶液在雾化小室内产生雾滴，并随气流飘散[6]。超声雾化机是应用超声的震动使溶液表面获得能量后，雾滴飘散脱离液体表面[7]。静电式雾化机是喷嘴处设置高压静电，使液滴带电荷而飘散[8]。石英振荡式雾化机是将液体放置在多孔小室内，经石英高频振荡后，在多孔喷嘴处形成雾滴，经外加流动空气带入患者呼吸道[9]。这些雾化手段在小分子(非基因性)药物雾化中已取得较好的雾化治疗效果，但对基因药物的雾化效果并不理想。

在雾化过程中保持质粒类长链的基因药物的完整性是影响肺转基因治疗的重要环节之一。临床常用的是机械喷射的雾化机，其结构简单，其他的雾化机较复杂的结构，但在基因雾化中，在保持质粒完整性环节，这些雾化机都表现出对质粒的破坏作用[10]。雾化机对基因转染雾化应用效果的研究表明:在没有修饰的质粒载体雾化中，气流喷射，机械振荡及超声方式对质粒的完整性都有较大的破坏。并且DNA越长，分子量越大，经这些方法雾化后完整性越差[5]。而静电喷射方式的雾化对基因破坏性要小一些[8]。另外，在雾化环节改变了基因药物其他的理化性质也会影响雾化治疗效果。首先，无论采用什么样的雾化机或雾化手段，直接雾化的效果表现在对液滴直径大小的影响，直径越大的液滴，越不易飘散，而直径小的液滴更容易进入到呼吸道末端，在肺内分散性也越好。其次，基因性药物为质粒DNA柔性大分子，在雾化环节容易被冲击破坏，可影响基因完整性和目的蛋白的表达。虽然雾化后产生的雾滴越小，对于肺内药物分布效果越好，但越小的雾滴在产生过程中，DNA分子受到的冲击力也越大，分子的完整性也越容易招到破坏。同时质粒等基因药物，在机械性雾化机中时间越长，被雾化的次数也就越多，受破坏的机会也就越大，长链的片段化也就越加明显[11]。为此兼顾两种作用新型雾化机的研制是基因雾化治疗中急需解决的问题。但无论应用什么样的手段或仪器，雾化的效果最好是产生的雾滴越小，同时DNA破坏性越小，就越能达到临床基因雾化需要。

在基因转染的过程研究中，无论哪种方式对基因治疗的定量问题都是难题，传统的雾化机是将动物放入密闭的容器内或用面罩给患者进行雾化，这种方式不仅浪费，而且定量较为不准确。为此瑞典的研究组设计了气管内给予雾化的给药方式，采用微量雾化喷头，经呼吸道在气管内进行雾化，并且在短时间内(如吸气时段期间)给予雾化，该方法不仅有节约效果，而且给予基因治疗能够定量相对精确[12]。王虹等[13]研究表明，利用这种气道内雾化方式可提高基因转然效率至300倍。对于病毒性载体可利用激光对溶液照射后产生蒸汽后雾化[14]。此外，雾化之后，对基因药物颗粒的大小和表面电荷的影响也应被考虑，有可能基因完整性可以保持完好，而基因药物的颗粒性质包括纳米级粒径和颗粒表面电势出现变化也会影响转染效果。

二、基因修饰物

肺脏转基因治疗载体分为病毒载体和非病毒载体。病毒类载体包括腺病毒和逆转录病毒。虽然病毒类载体对呼吸道内皮能进行有效转染，但病毒类载体具有抗原性和对机体潜在的威胁，会影响其在临床上的应用，重复使用病毒类载体会刺激机体产生抗体[15]。病毒载体对质粒大小有限制，而非病毒载体可以携带相对大的基因质粒[16]。但是，非病毒类基因载体必须克服物理，化学和生物性屏障，这是转基因治疗的主要障碍。非病毒性载体包括阳离子脂质体等高分子聚合物。目前，对基因载体修饰的高分子聚合物研究较为深入，已成为肺雾化基因治疗的主要基因载体修饰手段。

研究发现由DOTMA和DOPE组成的脂质体可以将基因性物质导入细胞内，由于DOTMA的脂质体表面拥有正电荷，同基因等物质的负电荷结合，与生物膜接触后可以与膜融合或内化方式将基因物质导入细胞内，DOTMA是人工合成的去垢剂，有18个炭原子、疏水链和一个氨基离子，掺入DOPE后可形成稳定的脂质体[17-18]。Crook等[19]发现阳离子脂质体可以应用到雾化吸入转基因治疗中，以保护基因不被核酸酶破坏。在动物肺中可以检测到目的基因表达，但也有研究表明应用阳离子脂质体修饰的基因质粒在雾化过程中造成基因损坏。Schwarz等[20-21]发现改变阳离子脂质体多种不同组分可以增加基因药物稳定性，从而增加基因转染效果。Colonna等[22]研究表明阳离子脂质体包裹的干粉可以携带基因物质进行雾化基因治疗。

另一种较为有代表性的高分子聚合物是PEI，是一种阳离子聚合物，它修饰后的基因具有在体外培养的细胞或组织中均转染效率，因其每三个原子中有一个是质子化的氮原子，因此具有较高的缓冲能力，并且可以将基因引导入核，PEI也可以保护基因不被酶降解[23-24]。Thomas等[25]研究表明，由于这种结合很牢固，PEI/DNA复合物一同进入细胞，甚至一同进入到细胞核，乃至在细胞内的基因和高分子聚合物不能完全被分开，从而可影响细胞内的生物利用效率，因此有研究对PEI进行多种方式的修饰改造，以增加生物利用度和减少细胞毒性。不同于PEI作用机制，阳离子脂质体和基因性物质结合后，具有细胞膜的相似性特征，其部分与生物膜结合，内容物进入到细胞质中，也有部分是以内吞的形式进入细胞[26]。

三、基因载体溶液物化性质对转基因效率的影响

在研究高分子聚合物对组织转染效果的实验中，发现在转基因的溶液某些性质改变可以影响转染效率，如改变溶液的酸碱度可以影响基因转染效率， pH值可能改变高分子聚合物和基因复合物颗粒的表面电势，从而影响复合物与细胞表面的关系[27]。也有研究表明低渗透压增加基因转染，渗透压可改变基因复合物颗粒的粒径，因此影响进入细胞的效率[28]。Sun等[29]研究推测低渗透压还可以通过升高细胞内钙离子浓度环节增强细胞对基因物质的摄取，从而增强细胞骨架运动方式，增加细胞内化活动，这样的推测符合已有报道[30]。Elfinger等[31-33]发现在溶液中加入细胞受体的配体后，可以增加细胞对基因物质的吸收利用度。推测可能是增强细胞相应的功能后增加了细胞的内化作用，但其机理没有作更深入研究。在动物模型上，雾化环节增加二氧化碳的浓度可以增强组织对基因转染效率，但其具体原因尚不清楚[4]。推测二氧化碳与兴奋呼吸中枢有关，但也不排除与改变酸碱度引起的纳米颗粒的物理化学性质变化有关。Li等[34]在雾化中适当添加氨基酸，发现可以增强转染效果，但机理仍不清楚。细胞功能可以影响细胞对外来基因物质的摄取过程，而细胞功能改变多伴随细胞能量的代谢改变，自由基产生量会发生变化。通过氧自由基对基因物质摄取的影响研究发现，氧自由基促进细胞对基因物质的摄入，这种增加摄入是依赖于钙调素激酶的活化引起细胞骨架变化而突现的。这一过程并不依赖于自由基引起的细胞钙信号升高。该结果支持自由基直接诱导细胞骨架改变[35]。此外，细胞功能的调节也可以调节基因转染效率。

四、雾化基因治疗的应用

在临床或动物模型上进行的雾化基因转染实验研究已经进行了多方面探讨。基因载体有多种高分子聚合物，治疗性的基因物质分为环形质粒和短链核苷酸。对动物机体进行的研究首先应明确的是外加基因能否表达、表达部位及机体安全性问题。Stribling等[36]指出：应用阳离子脂质体可以将质粒转入鼠肺脏组织中，表达部位在气管上皮，肺泡部位，同时强调该种方法不会引起组织学破坏。后来的研究表明，应用阳离子脂质体脂微球，进行肺组织基因转染，转染效果表明不受血清的影响，并可以保护DNA不被NDA酶破坏[13]。动物肺应用PEI进行基因修饰后可以得到更好的基因转染效果[4]，Vaysse等[37]研究表明，气管内皮细胞应用脂质体DOPAP将DNA与多肽P2结合，可使P2具有更高的基因表达。应用阳离子脂质体将重组人抗胰蛋白酶进行雾化吸入，7 d后可以在肺组织内检测到mRNA和蛋白水平的表达[3]。McLachlan等[38]通过DOPT进行雾化吸入目的基因， 8～9 d后可以矫正基因的缺失，起到治疗肺纤维化的作用。Gautam等[39]应用PEI包裹FITC标记的基因雾化后，检测其在肺组织中的分布，发现24 h～28 d均有药物分布。Jia 等[40]研究表明，PEI包裹的基因药物可以12 h后表达IL，并在7 d后抑制肿瘤生长。有研究发现传统的脂质体和PPDObREG可以增加转染，抑制肿瘤生长。而新的方法表明PEGDA和分子PEI可以视基因在组织中的表达保持7 d左右[41]。

转基因的表达时间大致在24 h到两周时间内，其后有表达量逐渐减少趋势。在研究在转质粒类基因转染治疗疾病种类中对肿瘤疾病研究较多，研究人员应用PEI-P53复合物质粒实现了对动物模型肿瘤生长的抑制[42]。Mitchell等[43]研究表明：通过阳离子脂质体可使HIV-1表面质粒在肺上皮细胞表达，引起体液免疫和细胞免疫，但不引起DNA抗体，应用该方法可以作为一种免疫治疗手段。Ma等[44]研究表明：雾化干扰素质粒可以调节小鼠肺部其他细胞因子的表达，推测通过该方法可以调节肺部局部免疫功能。Dames等[45]通过非病毒载体转染糖皮质激素受体后可增加该类激素的治疗效果。应用细胞周期调节信号的基因雾化方式PDCD4可以像抑制AP1方式一样抑制肿瘤生长[46]。

针对寡核苷酸反义序列进行雾化也有报道，如：蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)的反义雾化治疗可以抑制炎症，推测该方法可以治疗类似哮喘样的炎性疾病[47]。Molet等[48]研究了反义药物雾化后在肺组织中的分布，其主要分布于支气管核肺泡的上皮细胞，同时也研究了其毒性作用。近些年，小RNA干扰技术的研究也在雾化吸入基因治疗中得到应用，如应用雾化方式针对荧光酶素报告基因的干扰可以抑制80%～90%的基因表达[49]。针对Akt1 的干扰，应用siRNA可以抑制肺肿瘤的生长[50]。

肺脏的雾化基因吸入治疗是系统性治疗方法，需要更有利于基因完整性和产生更小颗粒的雾化机，以及具有组织深层渗透能力的基因物质载体。深入研究具有靶向性组织或细胞定位的转染方式，对肺雾化吸入治疗具有重要意义。无论是针对基因缺少的外源补充基因治疗，还是反义或小RNA干扰技术，目的基因治疗环节的选择对正常组织和病变组织都是至关重要的，需要对机体和疾病更深入的了解，才能满足临床治疗的需求。

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(本文编辑：黄红稷)

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10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.022

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2016-07-16)