姚允泰，龚志毅，李力兵，李立环( 中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外心血管病医院，心血管疾病国家重点实验室，北京0007;北京协和医院;解放军总医院)

不同七氟醚缺血处理方式对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的作用及其对基因表达谱的影响

姚允泰1，龚志毅2，李力兵3，李立环1
( 1中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外心血管病医院，心血管疾病国家重点实验室，北京100037;2北京协和医院;3解放军总医院)

摘要:目的比较七氟醚缺血预处理( SpreC)、七氟醚缺血后处理( SpostC)及SpreC + SpostC对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤( MIRI)的保护作用及其对心肌基因表达谱的影响。方法自主跳动的40只大鼠离体心脏经10 min平衡期灌注后，随机分为4组:对照( CTRL)组、SpreC组、SpostC组和SpreC + SpostC组。观察各组平衡期、缺血前及复灌15、60、120 min的血流动力学指标变化;各组缺血后复灌15 min，检测左室心肌烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD+)水平;平衡期和复灌120 min取各组冠状动脉流出液，检测乳酸脱氢酶( LDH)和磷酸肌酸激酶( CK-MB)水平;复灌120 min时测定心肌梗死面积及左室心肌取材行全基因芯片表达谱分析。结果与CTRL组比较，SpreC组、SpostC组和SpreC + SpostC组心脏功能改善、梗死面积减小、LDH及CK-MB水平降低( P均＜0.05)，且SpreC + SpostC的心肌保护效果优于单纯SpreC或SpostC( P均＜0.05)。SpreC组、SpostC组和SpreC + SpostC组心脏NAD+水平均高于CTRL组( P均＜0.05)，且SpreC + SpostC组高于SpreC或SpostC组( P均＜0.05)。基因谱分析显示，仅有少数基因同时受SpreC、SpostC和SpreC + SpostC同向调节。结论SpreC和SpostC能为大鼠离体心脏的MIRI提供程度相近的保护作用，二者联合应用效果更佳。不同七氟醚缺血处理方式对MIRI后心肌基因表达谱的影响不同。

关键词:再灌注损伤;七氟醚;线粒体通透性转换孔;基因芯片;大鼠

Effects of different modalities of sevoflurane conditioning on isolated rat hearts subjected to ischemia-reperfusion injury and the influence on gene expression profiles

YAO Yun-tai1，GONG Zhi-yi，LI Li-bing，LI Li-huan
( 1 Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，State Key Laboratory of Cardiovascular Diseases，Fuwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Beijing 100037，China)

Abstract:Objective To compare the cardioprotective effects of sevoflurane preconditioning ( SpreC)，sevoflurane postconditioning ( SpostC) and sevoflurane preconditioning plus postconditioning ( SpreC + SpostC) on the isolated rat hearts with myocardial ischemia-reperfusion injury ( MIRI)，and the influence on the myocardial gene expression profiles.Methods After 10 min of equilibration，the isolated rat hearts were randomly divided into four groups: the control group ( CTRL group)，SpreC group，SpostC group，and SpreC + SpostC group.Hemodynamics were compared within and between groups at baseline，before ischemia，at 15 min，60 min and 120 min upon reperfusion.The left ventricular myocardial nicotinamide adenine dinucleotide ( NAD+) were compared after 15 min of reperfusion.The coronary arteries ( coronary) effluent of each group were taken at equilibrium and 120 min of reperfusion to detect the levels of lactate dehydrogenase ( LDH) and creatine phosphate kinase ( CK-MB).Infarct size was determined at the end of 120 min of reperfusion.Left ventricular myocardium was collected at 15 min upon reperfusion to characterize the gene expression profiles.Results

Compared with the CTRL group，hearts in the SpreC，SpostC and SpreC + SpostC groups showed significantly better functional recovery，reduced myocardial infarct size，decreased LDH and CK-MB release ( all P＜0.05)，and the myocardial protective effect of the SpreC + SpostC group was better than that of SpreC or SpostC group ( all P＜0.05).Myocardial NAD+contents in the SpreC，SpostC，SpreC + SpostC groups were higher than that in the CTRL group ( all P＜0.05)，and SpreC + SpostC group was higher than either SpreC or SpostC group ( all P＜0.05).Microarray genome analysis dem-

onstrated that few genes were jointly regulated by SpreC，SpostC and SpreC + SpostC.Conclusions SpreC and SpostC were equally effective in protecting against MIRI.The combination of SpreC and SpostC offered additive protection.However，three sevoflurane treatment strategies had different influence on the myocardial gene expression profiles.

Key words:reperfusion injury; sevoflurane; mitochondrial permeability transition pore; microarray; rats

七氟醚是临床常用的挥发性麻醉药，有研究发现，七氟醚缺血预处理( SpreC)和七氟醚缺血后处理( SpostC)对心肌缺血再灌注损伤( MIRI)的保护作用效果相当［1～3］。但二者联合应用是否具有协同作用，目前的研究结论并不一致［1，3］。线粒体通透性转换孔( mPTP)是众多信号转导通路的集合点，被认为是MIRI信号通路中最重要的终末效应器［4］。2008年6月～2009年6月，我们比较了SpreC、SpostC、SpreC + SpostC对大鼠离体心脏MIRI的保护作用及mPTP的变化，并借助DNA微阵列技术初步探究不同七氟醚缺血处理方式对MIRI后心肌基因表达的影响。

1　材料与方法

1.1材料成年雄性SD大鼠40只，体质量200～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。压力换能器(美国BD公司) ; Biopac 5100生物信号采集系统、AcqKnowledge4.0软件(美国BIOPAC公司) ; Vapor2000七氟醚挥发罐(德国Drger公司) ; Hitachi7600自动生化分析仪(日本Hitachi公司) ; Beckman-DU640分光光度计(德国Beckman-Coulter公司) ; NanoDrop ND-1000分光光度计(美国Nano-Drop公司) ; DNA Microarray Scanner G2505B扫描仪、Agilent Feature Extraction 10.5.1.1软件(美国Agilent公司) ; GeneSpring6.0软件(美国Silicon Genetics公司) ; Rotor-Gene 3000 Realtime PCR仪(澳大利亚Corbett Research公司)。2，3，5-氯三苯四唑及乳酸脱氢酶( LDH)、肌酸激酶( CK-MB)试剂盒(德国Roche公司) ; TRIzol试剂盒(加拿大Invitrogen公司) ; RNeasy试剂盒(加拿大QIAGEN公司) ; Agilent芯片( Agilent 4×44 K Whole Rat Genome Oligo Microarray G4131A) (美国Agilent公司)。

1.2七氟醚缺血处理方法所有大鼠经腹腔注射苯巴比妥钠( 40 mg/kg)麻醉及肝素化( 1 000 IU/kg)，参照文献［5］建立改良非循环式Langendorff系统。自主跳动的离体心脏经10 min平衡期灌注后，随机分为4组、每组10只。对照( CTRL)组继续灌注K-H缓冲液25 min后，接受30 min全心缺血和120 min复灌; SpreC组:缺血前给予3%七氟醚饱和的K-H缓冲液灌注心脏15 min行预处理，后以未经

七氟醚饱和的K-H缓冲液灌注心脏实施洗出10 min，其余处理同CRTL组; SpostC组:缺血后复灌最初15 min给予3%七氟醚饱和的K-H缓冲液灌注心脏行后处理(后改用未经七氟醚饱和的K-H缓冲液继续灌注心脏)，其余处理同CRTL组; SpreC + SpostC组:联合使用SpreC组、SpostC组方案。K-H缓冲液以七氟醚通过挥发罐预先饱和。

1.3血流动力学指标检测在平衡期、缺血前及复灌15、60、120 min，通过Biopac 5100生物信号采集系统及相关软件，以1 000 Hz的频率在窦性节律时采集各组左室发展压力( LVDP)、左室舒张末期压力( LVEDP)、左室最大收缩及舒张速率( + dp/dt、－dp/dt)、心率( HR)及冠状动脉(冠脉)流量( CF)等信号，取2 s内的平均值。

1.4心肌损伤指标检测缺血后复灌15 min，各组随机各取离体左室心肌组织5份，参照文献［5］测定心肌中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD+)水平。各组在平衡期和复灌120 min收集离体心脏冠脉流出液1 mL，检测LDH、CK-MB水平。复灌120 min后，各组随机各取5个离体心脏，参照文献［5］测定心肌梗死面积。

1.5基因表达谱分析复灌120 min时，各组随机各取离体左室心肌组织3份，立刻置入液氮保存，随后转入－80℃，集齐所有标本后行基因表达谱分析。经单因素方差分析，校正后强度比值≥1.5倍的基因视为差异表达基因，并对其进行后续分析。为验证基因芯片结果的可靠性，从3个七氟醚处理组中各选取1个相对于CTRL组差异表达的目的基因，以管家基因GAPDH作为内参，进行实时定量PCR测定，并比对PCR和芯片测定的结果(变化方向及倍数)。每个基因的PCR反应均重复3次，PCR反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.6统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，结果比较采用重复测量方差分析、单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组不同时间血流动力学指标比较见表1。

2.2各组心肌组织NAD+水平、心肌梗死面积及冠脉流出液LDH、CK-MB水平比较见表2。

表1　各组不同时间血流动力学指标比较( n =10，珔x±s)

表2　各组心肌组织NAD+水平、心肌梗死面积及冠状动脉流出液LDH、CK-MB水平比较( n =5，珔x±s)

2.3基因芯片分析结果SpreC组、SpostC组及SpreC + SpostC组较CTRL组上调的基因数分别为21、289及160个，下调的基因数分别为19、310及219个。SpreC组上调及下调倍数最大的基因分别为TC607319(上调2.21倍)及Akr1b8(下调3.29 倍) ; SpostC组上调及下调倍数最大的基因分别为BF549419(上调5.12倍)及Akr1b8(下调5.62倍) ; SpreC + SpostC组上调及下调倍数最大的基因分别为Dhx36_predicted(上调3.65倍)及BF286392(下调5.92倍)。仅有少数基因同时受SpreC、SpostC 和SpreC + SpostC同向调节。SpreC组较SpostC组上调及下调的基因数分别为260、232个，上调和下调倍数最大的基因分别为Ucp3(上调9.05倍)和Ric8a(下调5.53倍)。SpreC + SpostC组较SpreC组上调及下调的基因数分别为164、193个，而较SpostC组上调及下调的基因数分别为34、42个:其中，SpreC + SpostC组较SpreC组上调及下调倍数最大的基因分别为Ric8a(上调5.53倍)及BF286392 (下调5.41倍) ; SpreC + SpostC组较SpostC组上调及下调倍数最大的基因分别为Ucp3(上调5.41倍) 及TC607319(下调3.59倍)。

3　讨论

七氟醚是临床常用的挥发性麻醉药。临床研究已经证实，七氟醚对接受冠脉搭桥患者的心肌保护效果优于静脉麻醉药异丙酚。不少研究也认为，SpreC和SpostC对MIRI均有保护作用［1，3，6，7］。然而，目前关于“联合应用上述两种抗MIRI手段是否能实现1 + 1＞1的心肌保护效果”的命题仍无定论。Deyhimy等［3］以Langendorff大鼠心脏的全心MIRI为实验模型，并以2.5%的七氟醚分别行缺血预处理、缺血后处理及联合处理，结果发现，与SpreC或SpostC比较，SpreC + SpostC能提供更好的心肌保护作用，即“1 +1＞1”。而Obal等［1］研究结果显示，联合应用2%七氟醚缺血预处理和缺血后处理并未为在体大鼠的局部MIRI提供“1 + 1＞1”的心肌保护作用。

本研究结果发现，与SpreC或SpostC比较，SpreC + SpostC能显著改善大鼠心功能、减轻心肌结构性损伤、降低心肌酶水平。说明SpreC和SpostC心肌保护作用可以叠加。有研究结果显示，麻醉药缺血预处理和麻醉药缺血后处理的保护机制存在相似之处，如均有mPTP参与［6，7］。线粒体内拥有组织中90%以上NAD+［8，9］，心肌缺血后复灌时，NAD+通过开放的mPTP从失活的及功能不全的线粒体被灌注液冲洗掉，故心肌组织中NAD+水平的高低能反映mPTP的开放程度，NAD+水平越低，mPTP的开放程度越大，心肌损伤程度越重［8，9］。本研究结果显示，SpreC + SpostC组心脏组织NAD+水平高于SpreC、SpostC组，提示SpreC和SpostC对mPTP开放的抑制作用在SpreC + SpostC呈现叠加效应。此外，本研究还比较了不同七氟醚缺血处理方式对大鼠MIRI后基因表达的影响，结果显示，仅见少数基因同时受SpreC、SpostC和SpreC + SpostC同向调节。提示尽管SpreC和SpostC均可提供短期内程度相当的抗MIRI作用，但二者对MIRI后基因表达的影响存在较大差异。

综上所述，SpreC和SpostC能提供相似的抗MIRI保护作用，二者联合应用效果更佳。但不同七氟醚缺血处理方式对心肌基因表达谱的影响不同。

参考文献:

［1］Obal D，Dettwiler S，Favoccia C，et al.The influence of mitochondrial KATP-channels in the cardioprotection of preconditioning and postconditioning by sevoflurane in the rat in vivo［J］.Anesth Analg，2005，101( 5) : 1252-1260.

［2］Lucchinetti E，da Silva R，Pasch T，et al.Anaesthetic preconditioning but not postconditioning prevents early activation of the deleterious cardiac remodelling programme: evidence of opposing genomic responses in cardioprotection by pre- and postconditioning ［J］.Br J Anaesth，2005，95( 2) : 140-152.

［3］Deyhimy DI，Fleming NW，Brodkin IG，et al.Anesthetic preconditioning combined with postconditioning offers no additional benefit over preconditioning or postconditioning alone［J］.Anesth Analg，2007，105( 2) : 316-324.

［4］Piriou V，Chiari P，Gateau-Roesch O，et al.Desflurane-induced preconditioning alters calcium-induced mitochondrial permeability transition［J］.Anesthesiology，2004，100( 3) : 581-588.

［5］Iwata K，Matsuno K，Nishinaka T，et al.Aldose reductase inhibitors improve myocardial reperfusion injury in mice by a dual mechanism［J］.J Pharmacol Sci，2006，102( 1) : 37-46.

［6］Li H，Wang JK，Zeng YM，et al.Sevoflurane post-conditioning protects against myocardial reperfusion injury by activation of phosphatidylinositol-3-kinase signal transduction［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35( 9) : 1043-1051.

［7］Chen HT，Yang CX，Li H，et al.Cardioprotection of sevoflurane postconditioning by activating extracellular signal-regulated kinase 1/2 in isolated rat hearts［J］.Acta Pharmacol Sin，2008，29( 8) : 931-941.

［8］Di Lisa F，Ziegler M.Pathophysiological relevance of mitochondria in NAD( + ) metabolism［J］.FEBS Lett，2001，492( 1-2) : 4-8.

［9］Di Lisa F，Menabò R，Canton M，et al.Opening of the mitochondrial permeability transition pore causes depletion of mitochondrial and cytosolic NAD+and is a causative event in the death of myocytes in postischemic reperfusion of the heart［J］.J Biol Chem，2001，276( 4) : 2571-2575.

·基础研究·

收稿日期:( 2015-03-14)

作者简介:第一姚允泰( 1978-)，男，副主任医师，主要研究方向为缺血再灌注损伤、器官保护。E-mail: yuntaiyao@126.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 81200109) ;高校博士点新教师基金资助项目( 20121106120008)。

文章编号:1002-266X( 2015)29-0017-04

文献标志码:A

中图分类号:R541.4; R614.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.29.006