王正彪，武怡，张静( 徐州医学院，江苏徐州000;徐州医学院附属医院)

哮喘及呼吸道合胞病毒感染小鼠肺组织NGF、LIF表达及地塞米松对其的影响

王正彪1，武怡2，张静1
( 1徐州医学院，江苏徐州221000;2徐州医学院附属医院)

摘要:目的观察支气管哮喘及呼吸道合胞病毒( RSV)感染小鼠肺组织中神经生长因子( NGF)、白血病抑制因子( LIF)的表达，探讨地塞米松对其表达的影响。方法将100只小鼠随机分为5组各20只，哮喘组制作哮喘模型，感染组制作RSV感染模型，合并组和地米组均制作哮喘合并RSV感染模型，地米组于造模第21～25天腹腔注射地塞米松，对照组腹腔注射并雾化吸入等量生理盐水。造模第26天处死小鼠，HE染色观察肺组织病理变化，RT-PCR法及免疫组化法分别检测肺组织NGF、LIF mRNA及蛋白相对表达量。结果哮喘组支气管、毛细支气管及伴行血管壁周围有大量嗜酸性粒细胞及单核细胞等炎症细胞浸润，支气管黏膜增厚，血管扩张，血管平滑肌增生肥厚;感染组支气管管腔狭窄甚至闭塞，肺泡上皮肿胀，肺泡间隔增宽，间质性水肿;合并组兼具哮喘组、感染组的表现;地米组无明显炎症细胞浸润及间质性改变;对照组肺组织结构清晰，基本无炎症细胞浸润。各组NGF、LIF mRNA及蛋白相对表达量比较，地米组、对照组均低于合并组、哮喘组、感染组，合并组高于哮喘组、感染组，P均＜0.01;地米组和对照组比较，P均＞0.05。结论RSV感染小鼠肺组织NGF及LIF表达增加，合并哮喘时增加更明显，地塞米松干预对其肺组织NGF及LIF表达均有一定的抑制作用。

关键词:呼吸道合胞病毒;神经生长因子;白血病抑制因子;哮喘;地塞米松

呼吸道合胞病毒( RSV)是婴幼儿呼吸道感染常见的病原体之一，RSV感染可引起毛细支气管炎并向哮喘转化［1，2］。支气管哮喘的基本病变为气道的慢性炎症，基本特征是气道高反应( AHR)。有研究证实，豚鼠感染RSV后气道反应性明显增高［3，4］，但具体机制尚不明确。研究发现，气道的感觉神经及其营养因子与气道炎症的形成密切相关，其中神经生长因子( NGF)及白血病抑制因子( LIF)是参与及调控气道神经源性炎症的重要炎症因子［5，6］。地塞米松是长效糖皮质激素的一种，在哮喘的治疗中应用广泛，其作用机制主要有抗炎、抑制Th2细胞的活化和EOS脱颗粒等，但其是否可调控NGF、LIF的表达鲜见报道。2013年10月～2015年11月，我们观察了支气管哮喘与RSV感染小鼠肺组织NGF、LIF表达变化，探讨地塞米松对其表达的影响。

1　材料与方法

1.1材料清洁级健康雌性Balb/c纯系小鼠100只，6～8周龄，体质量( 22±2) g，由徐州医学院实验动物中心提供。HyClone改良型RPMI 1640培养基及FBS均购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，制备成RSV病毒悬液( TCID5010－6.5/mL) ;鸡卵白蛋白购自美国Sigma公司; Al( OH)3干粉购自上海生物工程有限公司; TRIzol总RNA提取试剂、TIANSscript cDNA第一链合成试剂盒及2× TaqRCR Master Mix购自天根生物科技(北京)有限公司，NGF、LIF mRNA及GAPDH的引物由上海生物工程有限公司设计及合成; Rabbit Anti-NGF beta(免疫组化)购自武汉博士德生物工程有限公司Rabbit Anti-LIF(免疫组化)购自北京博奥森生物技术有限公司，浓缩型DAB试剂盒及兔超敏二步法检测试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司HERAcell 150i细胞培养箱购自美国赛默飞世尔科技公司，DY-38型稳流稳压定时电泳( PCR)仪购自江苏分化分析仪器厂，Olympus BX51显微照相系统购自日本奥林巴斯公司。

1.2造模与干预将100只小鼠随机分为5组，各20只。哮喘组按文献［7，8］制作哮喘模型，感染组按文献［9，10］制作RSV感染模型，合并组及地米组参照上述两组的方法制作哮喘合并RSV感染模型，地米组于造模第21～25天腹腔注射地塞米松0.2 mg/( kg·d) ;对照组于第1、14天腹腔注射生理盐水0.2 mL，第21～25天给予37℃生理盐水20 mL雾

化吸入30 min。

1.3肺组织病理学检查饲养第26天，各组以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，无菌条件下分离出两侧肺组织。4%甲醛固定液固定右肺中叶和左肺上叶肺组织，制作石蜡切片。行HE染色，400倍光镜下观察肺组织病理改变。

1.4肺组织NGF、LIF蛋白检测采用免疫组化法。取石蜡切片，按免疫组化试剂盒说明书进行操作，阴性对照用PBS代替。细胞质染成棕色为阳性细胞，用图像分析软件测定NGF、LIF阳性部位，以平均光密度( IOD)值表示其表达量。

1.5肺组织NGF、LIF mRNA相对表达检测采用RT-PCR法。将右肺下叶制作组织匀浆，TRIzol液提取细胞总RNA，检测其纯度及完整性，按说明书逆转录mRNA为cDNA。NGF上游引物为5'-GTCAGTGTGTGGGTTGGAGA-3'，下游引物为5'-TTCTTGTAGCCTTCCTGCTG-3'，片段长度304 bp; LIF上游引物为5'-TGCTTGCTGGGTGTATGAAC-3'，下游引物为5'-TTCTGTGGGAGCCTGAACA-3'，片段长度356 bp; GAPDH上游引物为5'-CCTTCATTGACCTCAACTACA-3'，下游引物为5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，片段长度215 bp。反应条件: 94℃预变性3 min，94℃变性45 s，58.8℃( NGF)/57℃( LIF)/60℃( GAPDH)退火45 s，72℃延伸2 min 共35个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物于琼脂糖凝胶上电泳。凝胶成像分析系统测定目的基因与内参基因灰度值的比值，以此表示目的基因相对表达量。

1.6统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，方差齐时多组间比较用单因素方差分析( One-way ANOVA)检验，方差不齐时多组间比较用Dunnett T3检验，组间多重比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组肺组织病理学改变哮喘组支气管、毛细支气管及伴行血管壁周围有大量嗜酸性粒细胞及单核细胞等炎症细胞浸润，支气管黏膜增厚，血管扩张，血管平滑肌增生肥厚;感染组支气管管腔狭窄甚至闭塞，肺泡上皮肿胀，肺泡间隔增宽，间质性水肿;合并组兼具哮喘组、感染组的表现;地米组无明显炎症细胞浸润及间质性改变;对照组肺组织结构清晰基本无炎症细胞浸润。

2.2各组肺组织NGF、LIF mRNA及蛋白表达比较见表1。

表1　各组肺组织NGF、LIF mRNA及蛋白表达比较( n =20，珔x±s)

3　讨论

气道神经源性炎症学说认为，气管及支气管上皮可因炎症反应受损脱落，导致感觉神经末梢暴露并释放活性物质;这些递质可反作用于外周靶细胞引起神经营养因子升高［11］。NGF可由外周靶细胞合成，经轴突摄取后逆行转运至背根神经节细胞，具有促进神经细胞生长、存活和分化的作用，能增强神经突触的可塑性，从而刺激神经递质分泌增加［12］; NGF还具有非神经元细胞的生物活性，可参与和整合刺激自适系统的成熟及表达。据文献报道，NGF 与LIF同属神经生长因子家族成员，有相似的生物学活性［13］;二者均作为胞外刺激因子作用于效应细胞过程中，具有相同的信号转导通路。当一种因子受到抑制时，另一种因子的表达水平同样受到抑制，故二者共同参与哮喘的发病，在RSV感染后导致支气管哮喘发生过程中起协同作用［13］。

本研究显示，HE染色后镜下可见，感染组以炎性表现为主，无典型哮喘样病理改变;但合并组病理组织改变较哮喘组、感染组明显加重。据此推测RSV感染后并非直接导致支气管哮喘发生，而是在一定程度上加重哮喘病理组织损伤。另外，与对照组比较，哮喘组、感染组和合并组NGF、LIF mRNA及蛋白表达均增加，仅与地米组比较无统计学差异提示哮喘气道神经源性炎症的发生可能与多种神经营养因子共同作用有关，这些因子的作用机制相似但并非相同［14～16］;地塞米松可同时抑制这些因子表达，引起其他相关致病因子的表达障碍，在临床治疗过程中，寻找抑制神经生长因子的抑制剂可减少

RSV感染后发生哮喘的概率。本研究为哮喘的防治提供了新思路。

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收稿日期:( 2015-02-12)

通信作者:武怡，E-mail: 2858643598@ qq.com

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0032-03

文献标志码:B

中图分类号:R-332

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.012