通信作者：曹治兴，博士，讲师，主要从事肿瘤分子生物药效学和毒理学。E-mail：284886361@qq.com

广藿香油及其主要成分对斑马鱼胚胎发育毒性的比较研究

杨雨婷1，2何育霖1张雪1，2卢俊宇1李玉芝1何贝轩1彭成1，2曹治兴1，2*

1.成都中医药大学，四川成都611137；2.中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都610075

【摘要】目的：观察和比较广藿香油及其主要成分广藿香醇、广藿香酮对斑马鱼胚胎发育的毒性。方法：分别将发育10h的胚胎置于梯度浓度的广藿香油、广藿香醇和广藿香酮中培养，于24h、48h、72h、96h观察和统计各组斑马鱼胚胎的死亡率、畸形率、胚胎形态、摆尾次数和心率。结果：随作用时间延长，三种药物毒性表现越明显；24h时广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼的LD50分别为50.3、12.9mg/L，广藿香油组无明显致死现象； 96h时广藿香油、广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼胚胎的LC50分别为21.22、12.863、11.76mg/L。对比12mg/L浓度下三种药物的毒性，广藿香醇和广藿香酮在24h时主要表现为生长缓慢、止于体节期，96h时表现为导致幼鱼脊柱侧弯，心脏肿大，卵黄囊肿大、摆尾次数和心率明显下降等现象；广藿香油在各时间点主要表现为延缓黑色素的生成和轻微的心脏毒性；对比结果表明，广藿香酮毒性最明显。结论：广藿香油、广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼均有胚胎发育毒性，毒性大小：广藿香酮>广藿香醇>广藿香油。

【关键词】广藿香油；广藿香醇；广藿香酮；斑马鱼；胚胎发育毒性

基金项目：国家自然科学基金项目(81403149)；四川省科技厅项目(12JC0613)。

作者简介：杨雨婷，研究生在读，主要从事中药药理与毒理学研究。

【中图分类号】R927

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2015)21-0014-03

Abstract:Objective To study the comparation of oil of Pogostemon cablin and its main monomer in Development of Zebrafish Embryos from 0 to 96h post fertilization(96h). Methods The embryos exposure ladder concentrations for the oil of Pogostemon cablin, Patchouli and Pogostone at 10h. It were cultured for 96h. LC50,relative survival rate,spontaneous movement of embryos heart beat rate and morphologic change were detected in 10h zebrafish embryos with incubation of the oil of Pogostemon cablin and its main monomer for 96h. Results Control group was established. With the extended time,the toxicity was more obviousely.24h，the LC50 value of the oil of Pogostemon cablin in the zebrafish embryos couldn’t calculate during the exposure concentrations. The LC50 values of Patchouli and Pogostone were 50.3、12.9mg/L, respectively; 24h，The LC50 values of the oil of Pogostemon cablin, Patchouli and Pogostone were 21.2、12.9、11.8mg/L, respectively.12 mg/L for the oil of Pogostemon cablin, Patchouli and Pogostone caused malformations in development of embryos, 24h, the embryos was hypoplasia and during the somites; 96h, zebrafish larvae with the characteristic of notochord malformation, cardiac edema, yolk edema. The three drugs inhibited time-dependent, especially Pogostone; 24h,Patchouli and Pogostone caused the reduction of spontaneous movement and heart rate，the oil of Pogostemon cablin had no effect on it. Conclusion The oil of Pogostemon cablin, Patchouli and Pogostone had toxicity on the development of zebrafish embryos,and the toxicity of zebrafish embryos : the oil of Pogostemon cablin >Patchouli>Pogostone.

Keywords:the oil of Pogostemon cablin; Pogostone; Patchouli; Zebrafish; Embryos; Safety

收稿日期：(2015.07.15)

Safety Evaluation of Oil ofPogostemoncablinand its main monomer in Development of Zebrafish Embryos

YANG Yuting1,2HE Yulin1ZHANG Xue1,2LU Junyu1Li Yuzhi1,2HE Beixuan1PENG Cheng1,2CAO Zhixing1,2*

1.Chengdu University of Traditional Chinese Medision,Chengdu 611137,China；

2.State Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of TCM,Chengdu 610075,China

斑马鱼为鲤科短担尼鱼属，原产于南亚，是一种常见的热带鱼。斑马鱼为体外受精，胚胎发育透明，便于观察，且与人类基因的相似度达到87%，对药物反应与人临床反应相似，是毒理学评价的重要模型[1]。同时，斑马鱼个体小，能大规模繁殖，便于大量获取实验所需样品，有着传统整体动物和细胞不可比拟的优势，成为当前生命科学研究中常用的三种主要模式脊椎动物之一。

广藿香是唇形科刺蕊草属植物广藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.的干燥地上部分，其味辛，性微温，归脾、肺、胃经[2]，为湿浊中阻呕吐之要药，可单用或配伍用于治疗妊娠呕吐属气滞湿阻。《本草图经》记载广藿香为“治脾胃吐逆为最要之药”。挥发油是广藿香的主要有效物质，而广藿香醇和广藿香酮为挥发油中的主要成分[3，4]。现代研究表明，广藿香油、广藿香醇和广藿香酮有抗菌作用；广藿香醇有抗肿瘤和神经保护的作用[5-8]，具有开发为抗菌药物和抗肿瘤药物的潜力，但安全性尚不清楚。研究采用模式动物斑马鱼，旨在探讨和比较广藿香油及其主要成分的胚胎毒性。

1材料

1.1实验药物广藿香油、广藿香醇、广藿香酮(批号：20150130，成都中医药大学药物研究所)，均以二甲基亚砜(DMSO)配成200 g/L的浓缩液。实验室用斑马鱼胚胎繁殖培养液 (13.7mmol/L NaCl，0.54 mmol/L KCl，0.025 mmol/L Na2HPO4，0.044 mmol/L KH2PO4，1.3 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，0.42 mmol/L NaHCO3)稀释。

1.2实验动物健康AB品系野生型斑马鱼，培育于成都中医药大学斑马鱼实验室。

1.3仪器Leica 型体视荧光显微镜(M165Flc)；斑马鱼循环水养殖系统(北京爱生科技公司)；微量移液器(德国Eppendorf公司)；MGC-100光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.4试剂氯化钠、碳酸氢钠、氯化钾等试剂均为分析纯；二甲基亚砜(DMSO，批号：SZBE0170V，SIGMA公司)。

2方法

2.1胚胎收集依照斑马鱼及相关实验技术[9]中所述方式，将斑马鱼养殖在控制光周期为14∶10(即光照14h，黑暗10h)，水温控制在28.5±0.5℃的条件下，每日饲喂新出壳幼虾两次。繁殖时，将斑马鱼按雌：雄=1∶1的比例放入繁育盒内，并用隔板分离。次日，光照期开始时，抽去隔板完成交配，3h后吸去粪便等污物，用新鲜培养液冲洗两次，置于恒温培养箱中培养，温度27.5~28.5℃。

2.2给药将受试药物的浓缩液用鱼卵培养液按二倍梯度稀释为6个浓度，即100、50、25、12、6、3、1.5mg/L。带斑马鱼发育至10h时，按15个/孔置于24孔板，将胚胎分为溶剂对照组、广藿香油、广藿香醇和广藿香酮的各剂量组，分别加入相应的药液，其中溶剂对照组加入DMSO，并设置空白对照。所有胚胎均置于恒温培养箱中孵育。

2.3观察指标

2.3.1对斑马鱼胚胎发育的死亡率、存活率及LD50死亡率是药物对斑马鱼胚胎发育毒性最直观的指标，从10h起连续培养在对应浓度的对照组和药液中，分别在24h、48h、72h、96h，于显微镜下观察记录各组斑马鱼胚胎的死亡和存活情况，并计算不同时间点的LD50。死亡率=死亡数/胚胎总数×100%；成活率=成活数/胚胎总数×100%。

2.3.2对斑马鱼胚胎发育的畸形率以上三种药物斑马鱼胚胎发育至48h时开始出现畸形，因斑马鱼胚胎发育至96h基本完成，统计48~96h期间斑马鱼胚胎发育的畸形率。畸形率=胚胎畸形数/胚胎总数×100%。

2.3.3对斑马鱼胚胎发育的摆尾次数斑马鱼最初的运动特征为24h的自主抽动，即摆尾次数，是由脊柱的运动神经支配肌肉系统发生的。斑马鱼胚胎发育至24h时尾部开始抽动。记录24h时每个浓度下1min内斑马鱼胚胎鱼尾的摆尾数。

2.3.4对斑马鱼胚胎发育的心率48h斑马鱼心脏发育完全，对于心跳次数的统计可观测药物在胚胎心脏发育时期的作用的强弱。斑马鱼胚胎发育至48h，其心脏发育基本完成。记录30s内斑马鱼胚胎心脏跳动次数。

2.4数据分析采用SPSS17.0统计分析软件包建立数据库，采用Bliss法计算LD50；计量数据采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3结果

3.1对斑马鱼胚胎发育的LD50于10h给予不同浓度的广藿香油、广藿香醇和广藿香酮，在不同的暴露时间点以胚胎死亡为终点观察指标，结果显示，随着给药浓度的增加和暴露时间的延长，3种药物对斑马鱼的致死性越强。24h时，广藿香酮和广藿香醇对斑马鱼胚胎的LD50分别为50.3、12.9mg/L，广藿香油在实验浓度内未表现出明显的致死性。96h时，广藿香油、广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼胚胎的LD50分别为21.2、12.9、11.8mg/L，见下表1。结果表明，三个药物均对斑马鱼均有胚胎发育毒性，其毒性由大到小分别为广藿香酮>广藿香醇>广藿香油，且毒性与药物浓度和暴露时间密切相关。

表1　广藿香油、广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼胚胎发育的LD50(24h、96h)

3.2对斑马鱼胚胎存活率的影响斑马鱼胚胎发育至10h期时，分别给予12mg/L的广藿香油、广藿香醇和广藿香酮，对比相同浓度下三种药物在24h、48h、72h和96h时对胚胎存活率的影响。结果显示，在相同作用时间和作用浓度下，毒性从大到小依次为广藿香酮> 广藿香醇>广藿香油(如图1)。随着暴露时间延长，斑马鱼胚胎的蓄积毒性增强。

3.3对斑马鱼形态的影响斑马鱼胚胎发育至10h期时，分别给予12mg/L的广藿香油、广藿香醇和广藿香酮，对比相同浓度下三种药物在不同时间点对斑马鱼胚胎的致畸性。结果显示，24h时，对照组正常发育。广藿香油组形态发育正常，黑色素合成减少；广藿香醇组发育止于17-体节期；广藿香酮组发育止于20-体节期，头部及尾部开始出现混浊。96h时，对照组形态和心脏发育正常， 12mg/L广藿香油组脊柱微弯，心脏略微肿大；广藿香醇组脊柱明显弯曲，心脏肿大，心房和心室发育畸形；广藿香酮组脊柱严重侧弯，卵黄囊肿大，尾部混浊(如图2)。同时，三种药物对斑马鱼的致畸率随着暴露时间的延长而逐渐增加，以广藿香酮的致畸率最高，广藿香油的致畸率最低(如图3)。结果表明，三个药物对斑马鱼胚胎均具有致畸性，其中广藿香酮毒性最明显。

3.4对斑马鱼摆尾次数的影响斑马鱼胚胎发育至24h，其尾部会表现出强烈的抽动，当将其暴露于上述药物时，由于发育异常而影响此摆尾活动。斑马鱼胚胎10h给予不同浓度的广藿香油、广藿香醇和广藿香酮，24h观察。结果显示，与正常对照组比较，广藿香醇和广藿香酮组斑马鱼胚胎的摆尾次数显著减少(P<0.05)，广藿香油组均数减少但无统计学意义(P>0.05)。结果见表3。

表3　广藿香油、广藿香醇和广藿香酮作用24h对斑马鱼摆尾次数的影响　 ± s)

3.5对斑马鱼心率的影响心脏的跳动是受交感神经和副交感神经的共同调节。通过心脏跳动的快慢，能够直接检测斑马药胚胎心脏发育情况，并间接推断斑马鱼胚胎神经发育的情况。斑马鱼胚胎发育至10h时加药，于48h在显微镜下分别记录12mg/L浓度下广藿香油、广藿香醇或广藿香酮对斑马鱼胚胎30s内心率的影响。结果显示，与正常对照组比较，广藿香酮组和广藿香醇组斑马鱼胚胎心率均显著减慢，有统计学意义(P<0.05)，广藿香油组均值减少但无统计学差异(P>0.05)。结果见表5。

表5　广藿香油、广藿香醇和广藿香酮对斑马鱼心率的影响 ± s)

4讨论

广藿香是临床上常用的芳香化湿药，主治湿阻中焦引起的恶心呕吐。广藿香油是广藿香的主要药效物质基础，并具有抗菌，抗肿瘤，神经保护等新功效。《中国药典》建议广藿香药材的用量为2~6g，对其广藿香油的用量并无剂量要求。目前，广藿香药材的传统用药剂量未见毒性报道，但由于新的功效剂量要求与传统用量存在差异，故对于其进行安全性评价意义重大。国内学者[10-13]用小鼠建立急性毒性模型，研究广藿香醇口服、腹腔注射均属低毒药物。然而由于模型的限制，仅能通过半数致死量一种指标作为判断药物毒性的依据，对于潜在的畸形未能做出统计。据国内文献报道[11-13]，斑马鱼作为新兴的动物模型，已被广泛用于研究药物对斑马鱼胚胎发育的毒性。斑马鱼胚胎发育整个过程透明可见，且孵化周期短，能在显微镜下实时观察药物对斑马鱼胚胎作用的致畸和致死变化。通过畸形率、存活率、心率、死亡率等指标推断斑马鱼毒性蓄积部位及蓄积过程，有助于填补其它动物模型在胚胎发育毒性评价中的空白。故本实验采用斑马鱼为模型，探讨广藿香油、广藿香醇和广藿香酮对胚胎发育的影响。

实验结果表明，在斑马鱼胚胎的整个孵化期，广藿香醇、广藿香酮的毒性大于广藿香油，而广藿香酮的毒性最大。三种药物随时间的增加，其毒性在斑马鱼体内均有蓄积效应，毒性及蓄积效应以广藿香酮最强，广藿香醇次之。

综上，广藿香油及其广藿香醇、广藿香酮对斑马鱼胚胎发育有致畸毒性和心脏毒性，提示在今后研究中有必要进一步采用其他动物实验以明确其是否具有胚胎发育毒性和心脏毒性，为临床安全用药提供依据。

参考文献

[1] Westerfield M． The Zebrafish Book [M]．Eugene：University of Oregon Press，1993．

[2] 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：中国医药科技出版社，2010．

[3] 王吉春．广藿香中挥发油成分的研究进展[J]．中医药指南，2010，8(11):43-45．

[4] Zhang Q，Li Z W，Zhu J Y．Studies on chemical constituents of the essential oil of Pogostemon cablin Benth [J]．West China J Pharm Sci，1996，11(4):249-250．

[5] 赵书策，贾强，廖富林．广藿香提取物的抗炎、镇痛药理研究[J]．中成药，2007，29(2):285-287．

[6] Yu Cui Li，Yan Fang Xian，Zi Ren Su，et al．Pogostone suppresses proinlfammatory mediator production and protects against endotoxic shock in mice [J]．Journal of Ethnopharmacology． 2014(157): 212-221．

[7] 黄晓舞，白林，徐风华，等．广藿香醇对(-淀粉样蛋白神经毒性的抑制作用[J]．解放军药学学报，2008(24)：338-340．

[8] Jin-LongYu，Xiao-Shi Zhang，Xia Xue，et al．Patchouli alcohol，an enssential oil of Pogostemon cablin，exhibits anti-tumorigenic activity in human colorectal cancer cells [J]．International Immunopharmacology．2013(16): 184-190.

[9] 董武．斑马鱼及相关实验技术[M]．青岛：中国海洋大学出版社，2006：6-8．

[10] 何景进，彭紹忠，谢庆凤，等．广藿香醇的急性毒性研究[J]．时珍国医国药，2012(23)：274-275．

[11] 陈怡君，蒲韵竹，颜惠，等．冰片对斑马鱼胚胎发育的安全性评价[J]．中国药房，2014(25)：1733-1737．

[12] 梁爱华．斑马鱼——一种可用于中药药效和毒性筛选的鱼类模型[J]．中国中药杂志，2009(34)：2839-2842．

[13] 蒙怡，刘华钢，梁瑜，等．氯化两面针碱对斑马鱼胚胎毒性的研究[J]．毒理学杂志，2012(26)：368-370．