邱东峰　殷明珠　张再君　辜大川

摘要：设计了一个新分子标记Wx-YMZC，改良检测Wx基因中（CT）n和G/T类型的方法，使用该标记只需要1次PCR扩增和1次酶切即可检测，简化了试验。此方法已获专利授权（专利号：ZL2013 1 0488947.7）。通过对55份水稻资源进行Wx基因型检测，分析和验证了不同Wx基因类型对直链淀粉含量的影响，即：①高AC（>22.0%）的资源具有较小n值（n≤14）的（CT）n重复次数的等位基因，在除糯米外的其他水稻资源中，具有低或中等AC的资源都具有较大n值（n≥16）的（CT）n重复次数的等位基因；②Wx基因中G型资源的AC高于T型资源；③Wx基因中存在着（AATT）n的重复序列，其中（AATT）6重复序列的资源多属于高AC，（AATT）5重复序列的资源多属于低或中等AC。还利用Wx-YMZC分子标记对13份R7606系列品系进行了应用研究。

关键词：水稻资源；Wx基因；直链淀粉含量；分子标记；R7606

中图分类号：S511 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6134-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.007

Abstract： Designed a new molecular marker associated with Wx gene，which had been authorized patents（ZL2013 1 0488947.7），meanwhile used this marker to detect 55 rice resources. Compared with the conventional method to detect the （CT）n and G/T type of the Wx gene， the new marker only use one PCR amplification and enzyme digestion，meanwhile， there were further analyses and validations of different Wx gene types on the influence of amylose content：1） Resources of high AC had allleles with smaller numbers of （CT） repeats， （i.e.，n≤14）， and conversely all resources of low to intermediate AC，except glutinous rice resources， had allleles with larger numbers of （CT） repeats，（i.e.，n≥16）；2） The amylose content with G type resources in Wx gene was higher than T ones； 3） Majorty of the resources with high AC had the （AATT）6 allele in the Wx gene，whereas most of the resources with low AC had the （AATT）5 allele.We analysed the （CT）n and G/T type of the Wx gene of 13 R7606 varieties.

Key words：rice resources；Wx gene； amylose content；molecular maker；R7606

随着生活水平的不断提高，越来越多的消费者选择优质稻米。直链淀粉含量（AC）是影响稻米品质最重要的因素。直链淀粉主要由Wx基因编码的颗粒性结合淀粉合成酶（GBSS）催化合成[1]，不同Wx基因类型的资源其AC存在差异。稻米的AC主要受Wx基因控制[2]。Bligh等[3]发现在Wx基因前导序列的第一内含子5′端剪切位点的上游55 bp处存在一段（CT）n的重复序列，针对该重复序列设计了一对标记“484/485”，一些学者对Wx座位进行了复等位基因的分析，发现（CT）n存在多态性，这些多态性与水稻直链淀粉含量之间存在显著的相关性[4-6]。但在后续的研究中发现标记“484/485”存在PCR扩增效果和重复性较差等问题。蔡秀玲等[7]设计一个CAPS标记PCR-AccⅠ，该标记在第一内含子5′端和第一外显子连接处的上下游设计了一对相距420 bp的引物，且这一区域中没有另外的AccⅠ的识别位点，PCR扩增片段为460 bp，经AccⅠ酶切后，在2%琼脂糖凝胶上电泳，若第一内含子+1位处是碱基G，则PCR产物能被酶切为403 bp和57 bp两个片段，若第一内含子+1位处是碱基T，则PCR产物不能被酶切因而仍为460 bp。

常规的检测方法使用标记484/485检测Wx基因中（CT）n，使用PCR-AccⅠ标记检测Wx基因中G/T的类型，需要进行2次PCR扩增和1次酶切反应。本研究设计一个新的与Wx基因相关的分子标记，使用该标记只需要1次PCR扩增和1次酶切即可检测出Wx基因中（CT）n和G/T的类型，简化了试验，降低了成本。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选用68份籼型黏稻资源（品系），其中56～68为创制的R7606系列[8]资源（表1）。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 引物Wx-YMZ：在NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索日本晴的Wx基因全序列，用primer3.0设计一对便于测序的引物Wx-YMZ，该引物扩增序列包含Wx基因前导序列第一内含子5′端剪切位点上游55 bp处的一段（CT）n的重复序列和第一内含子5′端SNP的G/T位点，扩增片段大小约为848 bp，其上游引物序列为：5′-GCGTCGTCATAGACAAAAGT-3′，下游引物序列为：5′-TGACCAACTCGGCTACTAAA-3′。

引物Wx-YMZC：将引物Wx-YMZ在55个优质水稻资源扩增产物中的测序结果与日本晴Wx基因序列相同区段使用DNAMAN软件进行比对分析，选取高度同源的保守区段重新设计新引物Wx-YMZC，该引物包含（CT）n的重复序列和与之最近第一内含子5′端SNP的一个G/T位点（惟一一个AccⅠ酶切位点），扩增片段大小约为186 bp，其上游引物序列为：5′-TCACCATTCCTTCAGTTCTT-3′，下游引物序列为：5′-TCTGAATAAGAGGGGAAACA-3′。

该引物的目的旨在通过10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳区分扩增产物中（CT）n中n值的变化，不需要引物PCR-AccⅠ的重新扩增，直接通过AccⅠ酶切该引物扩增的产物检测其G/T型的变化。

1.2.2 水稻DNA提取 在水稻分蘖盛期取叶片，采用CTAB法提取总DNA。

1.2.3 PCR与电泳 试验所用标记引物均由擎科公司合成，酶切所用AccⅠ酶购自TaKaRa宝生物工程有限公司。本研究中设计的测序引物Wx-YMZ反应在PCR扩增仪（BIO-RAD PTC-200 PCR仪）中进行。扩增体系为25 μL，其中DNA模板0.6 μL（50 ng/μL），10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.0 μL（2.5 mmol/L），引物Wx-YMZ 0.5 μL（10 μmol/L），1U TaqDNA聚合酶（5 U/μL），超纯水19.7 μL。热循环条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min；55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃下延伸10 min。

新引物Wx-YMZC扩增体系为10 μL，其中DNA模板1.0 μL（50 ng/μL），10×Buffer 1.0 μL，dNTPs 0.4 μL（2.5 mmol/L），引物Wx-YMZC 0.2 μL（10 μmol/L），1U Taq DNA聚合酶（5 U/μL），超纯水7.0 μL。热循环条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min；55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃下延伸10 min。

扩增产物用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，快速银染检测Wx基因（CT）n的变化。

AccⅠ酶切：扩增产物每管取10 μL，1.5 μL 10×酶解缓冲液，0.5 μL的10 U/μL AccⅠ酶，用无菌水补足至15 μL，混匀后于37 ℃保温1 h，在2%的琼脂糖凝胶中电泳，检测Wx基因的G/T多态性。

1.2.4 Wx等位基因的测序与序列分析 对引物Wx-YMZ在55个优质水稻资源扩增产物中的测序结果使用DNAMAN软件进行比对分析，统计各资源的Wx基因型。

1.2.5 稻米品质检测 在供试材料完全成熟后收种，参照优质稻谷GB/T17891-1999的品质分析方法，由农业部食品质量监督检验测试中心（武汉）分析测试68份资源的平均直链淀粉含量。

2 结果与分析

2.1 水稻资源的Wx基因型与直链淀粉含量

引物Wx-YMZ扩增55份水稻资源的产物测序结果和其直链淀粉含量具体见表2。

2.2 Wx基因（CT）n的变化

利用引物Wx-YMZ基因扩增产物测序结果可发现，在55份水稻资源中，共存在5种（CT）n的多态性变化，其重复数（即为n值）分别为20、18、17、13和11。

引物Wx-YMZC扩增出来的PCR产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图显示出的条带约为186 bp，共有5种带型，其中Basmati、Basmati Super fine各为单独一种带型；鄂中5号、霸王占、银占等33种水稻资源为一种带型；珠海占、04-657、R0521等12种水稻资源为一种带型；晚籼98、黄华占、西山占等8种水稻资源为一种带型，它们对应的CT重复数分别为20、13、18、11、17，该结果与引物Wx-YMZ基因扩增产物测序结果完全一致，带型如图1所示。

利用引物Wx-YMZ测序得到的结果显示，在Wx基因第一内含子中（即位于（CT）n重复序列下游的182 bp处），存在两种（AATT）n的多态性，即为（AATT）5和（AATT）6，其中Basmati、Basmati super fine、04-657等14份资源均为（AATT）6，鄂中5号、晚籼98、霸王占等41份资源为（AATT）5。

2.3 Wx基因的G/T多态性

分析引物Wx-YMZ基因扩增产物测序结果可发现，G型资源共有14份，T型资源共有41份。

引物Wx-YMZC扩增产物能被AccⅠ酶切的资源共有14份，能被AccⅠ酶切后的两种条带约为137 bp（该片段包含（CT）的重复）和49 bp，其结果与引物Wx-YMZ基因扩增产物测序结果完全一致，见图2。

2.4 Wx等位基因类型与AC分析

综合以上结果，可将Wx基因分为5种等位基因型，其中以41份T型资源的Wx基因前导序列区的重复数类型为主，分别为（CT）18和（CT）17；14份G型资源共有3种，分别为（CT）20、（CT）13和（CT）11。G型水稻资源的Wx基因第一内含子中（即位于（CT）n重复序列下游的182 bp处）的（AATT）n的重复数均为6，T型水稻资源的（AATT）n的重复数均为5，结合AC检测结果分析可以看出，在55份材料中，G型的直链淀粉含量大于或等于20.60%，T型的直链淀粉含量小于或等于19.12%，G型的直链淀粉含量明显高于T型。

2.5 应用Wx-YMZC分子标记初步评价13份R7606品系

选取13份R7606品系，应用Wx-YMZC分子标记结合AccⅠ酶切，分析其Wx基因型。结果如图3所示。由图3可以看出，13份R7606品系对应的（CT）n与材料3晚籼98指示结果一致，表明它们的n值均为17；由图4可知，13份R7606品系均不能被AccⅠ酶切，表明它们均属于T水稻资源，综合分析可以得出，它们均属于中等直链淀粉含量，这与稻米品质检测结果一致（表3）。

3 小结与讨论

3.1 引物Wx-YMZC与Wx基因型的检测

本试验设计的新引物Wx-YMZC主要是针对检测Wx基因的（CT）n和G/T型而设计的，其检测出的结果和常规引物484/485与引物PCR-AccⅠ经AccⅠ酶切后的结果完全一致，且聚丙烯凝胶电泳图和琼脂糖电泳图的效果均比较理想，说明新引物Wx-YMZC在检测Wx基因的（CT）n和G/T型方面具有良好的可靠性与可行性。

3.2 Wx基因类型与稻米品质的关系

谈移芳等[9]的研究表明高直链淀粉含量（>22.0%）的品种具有较小n值（n≤14）的（CT）n重复次数的等位基因，相反，在除糯米外的其他水稻品种中，具有低的或中等直链淀粉含量的品种都具有较大n值（n≥16）的（CT）n重复次数的等位基因。本研究中，Wx基因（CT）n重复的n值在14以下的资源共有13种，且这13种资源的直链淀粉含量均高于20%，属于高直链淀粉含量的资源；Wx基因（CT）n重复的n值在16以上的非糯稻资源共有55种，除Basmati（n=20）外，其余41种非糯稻资源（n=17或18）的直链淀粉含量均在18%以下，属于中低等直链淀粉含量的资源，这与前人的研究结果相符。蔡秀玲等[7]研究结果表明，Wx基因第一内含子+1位处碱基的单核苷酸多态性G/T位点与水稻成熟种子的直链淀粉含量性状紧密连锁，共分离。若Wx基因第一内含子+1位碱基为G，则水稻成熟种子中的直链淀粉含量均高于20%，相反，若为T，则直链淀粉含量均低于18%。尽管Basmati（n=20）的n值大于16，但是直链淀粉含量依然高于20%，属于高直链淀粉含量的资源。

谈移芳等[9]的研究同时证明，在（CT）n重复序列下游的182 bp处，存在一个（AATT）n的重复序列，在不同的水稻资源中，（AATT）6重复序列的资源多属于高直链淀粉含量，（AATT）5重复序列的资源多属于低或中等直链淀粉含量。本研究中，Wx基因中（AATT）5重复序列的资源共有41种，除1号（Basmati）外，其余40种非糯稻资源均为低或中等直链淀粉含量，（AATT）6重复序列的资源共有14种，且这三种资源均为高直链淀粉含量（高于20%），这与前人研究结论一致。Basmati资源尽管含有（AATT）5的重复序列，但由于Wx基因第一内含子+1位处碱基为G，其直链淀粉含量依然高于20%，属于高直链淀粉含量的资源。

在本试验中讨论的Wx基因类型中，Wx基因第一内含子+1位处SNP位点突变G/T的变化对直链淀粉含量影响起着决定性的作用。

3.3 引物Wx-YMZC在水稻育种中的应用

非糯水稻资源中稻米直链淀粉含量的高低与Wx基因的第一内含子的剪接效率有关，其供位+1是G/T碱基，会影响稻米的直链淀粉含量；同时Wx基因中（CT）n重复次数也与稻米直链淀粉含量极显著相关。本研究开发的新引物Wx-YMZC可同时检测Wx基因中（CT）n和G/T的类型，但只需要进行1次PCR反应和一次酶切反应，PCR的反应产物既可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（CT）n类型，又可进行酶切反应通过琼脂糖电泳检测G/T的类型，一个产物两种用途。与常规使用两个标记的方法相比，新标记所扩增产物以及酶切产物条带清晰，实验结果可靠，在不影响原有检测结果的基础上，具有减少检测成本，缩短检测周期的优势，更适宜大规模检测。

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