徐国旗　华再东　张立苹　肖红卫　刘西梅　许生成　郑新民

摘要：为提高卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的能力，探讨了双丁酰基腺苷酸环化酶（db-cAMP）和卵丘细胞单层共培养对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育潜力。结果表明，成熟培养液中分别添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-cAMP时，卵母细胞的体外成熟率依次降低，但浓度为1 mmol/L时的孤雌胚囊胚率（27.03%）显著高于其他各组（P<0.05）；卵丘细胞单层共培养卵母细胞时，其成熟率、卵裂率及囊胚率（86.00%、89.04%、28.36%）也得到了显著提高；0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘细胞单层共培养时，其成熟率和卵裂率（85.78%和88.95%）与对照组差异不显著，但囊胚率（35.14%）显著提高。0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘细胞单层共培养能够显著提高猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎的发育潜力。

关键词：db-cAMP；卵丘细胞单层；体外发育；猪

中图分类号：S828 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6303-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.053

Abstract： To improve the developmental potential of pig oocytes in vitro maturation and parthenogenetic embryos， the effects of db-cAMP concentration and cumulus cells monolayer on in vitro maturation and parthenogenetic potential of pig oocytes was investigated. The tests indicated that as the concentration of db-cAMP increased （0、0.5、1.0、1.5 and 2.0 mmol/L）， the maturation rate of oocytes reduced successively. But the blastocyst rate of 1 mmol/L group（27.03%） was significant higher than others（P<0.05）； When oocytes were co-cultured with pig cumulus cell monolayer， the maturation rate、cleavage rate and blastocyst rate（86.00%、 89.04%、 28.36%） were significantly improved. 0.4 mmol/L db-cAMP co-cultured with the monolayer cumulus cell had no significant difference in maturation rate and cleavage rate（85.78% and 88.95%）， but the blastocyst rate（35.14%） were significantly improved. 0.4 mmol/L db-cAMP co-cultured with monolayer cumulus cell can improve the development of parthenogenetic embryos.

Key words：db-cAMP；cumulus cell monolayer；in vitro development；pig

随着胚胎生物技术的发展，猪卵母细胞体外成熟及发育能力已成为体外受精（IVF）、胞浆单精子注射（ICSI）和核移植（NT）等技术成功的关键[1]。然而，目前猪卵母细胞体外成熟系统并不完善，体外成熟培养时间较长，许多理化因素直接或间接地影响着卵母细胞的体外成熟及后期发育。研究表明，猪的卵母细胞核在38 h就完成了核的成熟，而胞质的成熟则要到42 h左右才能完成，核质成熟的不同步可能是影响猪卵母细胞体外发育的主要因素[2]。部分卵母细胞在体外培养过程中能自发恢复减数分裂从而使细胞核成熟，但是细胞质的成熟往往要滞后于核的成熟而导致卵母细胞成熟质量差，最终影响后期胚胎的发育[3]。因此，提高卵母细胞的体外成熟质量，使其卵母细胞核、质同步成熟，获得较强的发育能力，是提高体外胚胎生产效率的一个重要环节[4，5]。

腺苷酸环化酶（cAMP）是一种主要由卵丘细胞分泌产生的核成熟抑制因子，可通过与卵细胞间隙连接相互影响，从而维持cAMP的水平，提高卵母细胞的发育能力[6，7]。cAMP的水平在哺乳动物卵母细胞减数分裂阻滞和恢复中起着决定性作用，高水平的cAMP能够阻滞卵母细胞生发泡破裂（Germinal vesicle breakdown， GVBD），只有当卵母细胞内cAMP的水平下降到一定程度时才能启动卵母细胞的减数分裂[8]。双丁酰基腺苷酸环化酶（db-cAMP）是cAMP类似物，在体外成熟过程中同样能够阻滞卵母细胞减数分裂进程，在成熟培养液中添加适量db-cAMP，适当延缓细胞核的成熟，达到核质成熟同步，从而可在一定程度上提高卵母细胞的质量[9]。然而，猪卵母细胞体外成熟培养时对db-cAMP的剂量依赖性较大，其最佳添加浓度还有待进一步研究。此外，卵丘细胞不仅能够产生大量的cAMP，并且在卵母细胞生长发育、体外受精、胚胎发育等过程中都起着重要作用[10]。目前卵丘细胞对卵母细胞体外成熟影响的研究主要集中在卵丘细胞层数方面[11]。本试验以屠宰场采集的猪卵母细胞为研究对象，在db-cAMP、卵丘细胞单层及其共培养时，研究了卵母细胞体外成熟及其后期胚胎发育能力的影响，为优化卵母细胞体外成熟体系提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

除特别标识外，所有化学试剂均购自Sigma公司（St. Louse，MO，USA）；洗卵液（DPBS）以及TCM-199购自Gibco公司；孕马血清促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）由宁波激素制品厂生产。

1.2 方法

1.2.1 猪卵母细胞的采集和体外成熟培养 从当地屠宰场采集新鲜卵巢，放入30～37 ℃含青、链霉素的生理盐水中，1.5 h内运回实验室。用生理盐水（37 ℃）冲洗干净后置于37 ℃水浴锅中。用配有16号针头的10 mL注射器抽吸直径为3～6 mm的卵泡，收集卵泡液于50 mL的离心管中，静置10～20 min后，从底部沉淀物中捡取卵丘包裹3层以上的卵丘卵母细胞复合体（COCs），经添加PVA的DPBS洗涤3遍，再用CO2培养箱内平衡2 h以上的猪卵母细胞成熟培养液（TCM-199+3.05 mmol/L葡萄糖+0.91 mmol/L丙酮酸钠+1 mmol/L L-谷氨酰胺+0.57 mmol/L L-半胱氨酸+10%pFF +10 IU/mL hCG+10 IU/mL PMSG+75 μg/mL青霉素+ 50 μg/mL硫酸链霉素）洗涤3遍。将洗好的COCs放在39 ℃、100%湿度、5% CO2培养箱中培养（20±2） h，随后转移到无hCG和PMSG的成熟培养液中继续培养（20±2） h。将扩散良好的卵母细胞用0.1%的透明质酸酶反复吹打数次脱去颗粒细胞，再用DPBS洗卵液清洗2～3次，挑选卵母细胞胞质浓稠、卵周间隙明显、排出第Ⅰ极体的卵母细胞备用。

1.2.2 猪卵丘细胞单层的制备 取COCs用0.1%透明质酸酶脱去周围的卵丘细胞，去除机械裸卵（DOs） 后将剩下的液体置于1.5 mL离心管中，静置数分钟后吸取中上层液体离心，经成熟培养液洗3次后，转移至24孔板（0.5×106～1×106个/孔）中，置于39 ℃、5% CO2、湿度100%的培养箱培养，待细胞长成卵丘颗粒细胞单层时备用。

1.2.3 孤雌激活 将成熟后脱去卵球的卵母细胞用融合/激活液（0.25 mol/L甘露醇+0.5 mmol/L 氯化钙+0.5 mmol/L 硫酸镁+0.5 mmol/L HEPES+0.01% PVA）洗涤3次，分批放入已经铺满融合液，电极宽度为1 mm的融合槽（BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽）中，用ECM2001（BTX，USA）融合仪施加一个30 μs，1.3 kv/cm的1次直流电脉冲激活，再用添加4 mg/mL BSA的NCSU-23洗涤3～5次，随后转入矿物油覆盖的胚胎培养液（NCSU-23）中，在39 ℃、5% CO2、湿度100%的培养箱中培养48 h后观察并记录卵裂情况，7～8 d后观察记录囊胚发育情况。

1.2.4 db-cAMP对卵母细胞成熟及孤雌胚胎体外发育的影响 用添加不同浓度db-cAMP（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L）的成熟培养基体外成熟培养22 h后转入无激素及db-cAMP的成熟培养液中继续培养22 h，统计第Ⅰ极体排出率，并进行孤雌激活，观察记录早期胚胎发育情况。

1.2.5 卵丘细胞单层共培养对卵母细胞成熟及孤雌胚胎体外发育能力的影响 试验分为4组：①对照组（COCs单独培养）；②COCs+卵丘细胞单层；③机械裸卵（Dos）+卵丘细胞单层；④Dos单独培养。44 h后统计第Ⅰ极体排出率，并进行孤雌激活，观察记录早期胚胎发育情况。机械裸卵（Dos）是将成熟培养前选取的COCs用0.1%透明质酸酶脱除包裹在其周围的卵丘细胞得到。

1.2.6 db-cAMP与卵丘细胞共培养对卵母细胞成熟及孤雌胚胎体外发育潜力的影响 选取最适浓度的db-cAMP添加到成熟培养基与卵丘细胞单层共培养22 h，随后转入到无激素及db-cAMP的成熟培养液中继续培养22 h，统计第Ⅰ极体排出率，并进行孤雌激活，随后观察记录早期胚胎发育情况。

1.3 统计分析

所有数据用卡方方法进行分析检验，P<0.05为差异显著，每个试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 COCs细胞及胚胎发育情况

捡取卵丘包裹3层以上的卵丘卵母细胞复合体（COCs）（图1A）进行体外培养44 h。挑选卵母细胞胞质浓稠、卵周间隙明显、排出第Ⅰ极体的卵母细胞激活，激活后的卵母细胞如图1B所示。然后在39 ℃、5% CO2、湿度100%的培养箱中培养48 h后观察并记录卵裂情况如图1C所示；7～8 d后观察记录囊胚发育情况如图1D所示。

2.2 不同db-cAMP浓度对卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞在添加了不同浓度db-cAMP的成熟培养液中培养22 h后，转入不含db-cAMP和激素的成熟培养液中继续培养22 h。结果表明，猪卵母细胞成熟率随着db-cAMP浓度增加呈降低趋势。与对照组（71.37%）相比，浓度为0.5、1.0 mmol/L时的成熟率（69.57%和67.15%）差异不显著 （P >0.05）（表1），而浓度为1.5、2.0 mmol/L时（49.56%和34.30%）显著降低（P<0.05）。

孤雌激活后观察卵裂及囊胚发育情况，1 mmol/L组的卵裂率显著高于2 mmol/L和3 mmol/L组（P<0.05），而与对照组及0.5 mmol/L组间差异不显著（P>0.05），但其囊胚率显著高于其他各组（P<0.05）（表1）。

2.3 卵丘细胞对卵母细胞体外成熟的影响

由表2可以看出，在以卵丘细胞单层为饲养层的情况下，COCs经44 h成熟培养后成熟率、卵裂率、囊胚率均显著高于其他各组（P<0.05）。与对照组相比，机械裸卵在有或无卵丘细胞单层时的成熟率、卵裂率、囊胚率都显著降低（P<0.05），但卵丘细胞单层能显著提高机械裸卵的成熟率及后期胚胎发育能力（P<0.05）。

2.4 db-cAMP与卵丘细胞单层共培养对卵母细胞体外成熟的影响

选取1 mmol/L的db-cAMP为最适添加浓度，与卵丘细胞单层共培养，结果（表3）表明，当在共培养组中添加db-cAMP时卵母细胞的体外成熟率、卵裂率以及囊胚率（62.79%、71.96%和18.38%）都显著降低（P<0.05）。浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L db-cAMP与卵丘细胞单层共培养，卵母细胞体外成熟率随浓度增加呈递减趋势，但0.4 mmol/L db-cAMP与卵丘细胞单层共培养时，囊胚率最高（35.14%）。

3 小结与讨论

核质成熟不同步往往是影响卵母细胞体外成熟质量的主要因素，而卵母细胞内高水平cAMP可阻滞减数分裂的恢复，在一定程度上抑制核的成熟，从而达到核质成熟的同步化[9]。本试验通过添加一定剂量的核成熟抑制因子类似物db-cAMP来延迟核的成熟，力求达到核质同步成熟，提高体外胚胎质量。结果表明，db-cAMP对卵母细胞核成熟的抑制作用具有明显的剂量依赖性。随着剂量的增加，卵母细胞的成熟率呈现递减趋势，然而添加剂量为0.5和1.0 mmol/L时，成熟率的降低并不影响后续胚胎发育的卵裂率及囊胚率，添加1.0 mmol/L的db-cAMP能显著提高孤雌胚胎的后期发育能力。这与Zhao等[12]关于体外添加db-cAMP能显著提高囊胚率的报道一致。

研究表明，卵丘-卵母细胞复合体（COCs）中cAMP主要来源于卵丘细胞，并通过与卵母细胞间的间隙连接运输到胞质中[7]，因此COCs中总的cAMP水平在一定程度上取决于卵丘细胞的数量。此外，卵丘细胞能将卵泡液中的胱氨酸转变为半胱氨酸，有助于卵母细胞对半胱氨酸的获取，从而促进卵母细胞的胞质成熟[13]。如果两者间缝隙连接被过早破坏 ，卵母细胞可能停止发育[14]。本试验结果表明，COCs与卵丘细胞单层共培养能显著提高卵母细胞成熟率及后期胚胎发育能力。将脱去卵丘后的机械裸卵与卵丘细胞单层共培养时能够极大地提高其体外成熟能力，这可能是由于裸卵不能直接利用葡萄糖，而卵丘细胞能够将葡萄糖转化为丙酮酸而被裸卵利用，从而为卵母细胞的生长和发育提供能量。此外，裸卵紧贴于卵丘细胞上，可能与卵丘细胞形成正常的间隙链接，或通过旁分泌，产生一些促卵细胞成熟因子，提高卵母细胞的成熟率及胚胎质量[15]。

本研究中，笔者设想通过添加适量的db-cAMP与卵丘细胞单层共培养来提高卵母细胞质量，然而结果表明，当卵母细胞在添加1 mmol/L db-cAMP的成熟培养液中与卵丘细胞单层共培养时，成熟率及卵裂率都大大降低。这可能是卵丘细胞单层产生了足够的cAMP，调节核质的成熟，再加入其类似物，其含量总和超过了最适抑制浓度，因而阻滞了卵母细胞的正常成熟。选取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L db-cAMP几个浓度与卵丘细胞单层共培养，结果表明，0.4 mmol/L db-cAMP与卵丘细胞单层共培养时，囊胚率得到了显著性提高。

综上所述，cAMP对卵母细胞的体外成熟和胚胎早期发育影响重大，1 mmol/L db-cAMP或0.4 mmol/L db-cAMP与卵丘细胞单层共培养时，能够较好地调节卵母细胞核质的同步成熟，从而在一定程度上提高孤雌胚胎早期发育能力。然而，0.4 mmol/L db-cAMP与卵丘细胞单层共培养时的囊胚率显著高于其他各组，这可能是由于卵丘细胞能够产生某些其他因子，从而促进了卵母细胞的胞质成熟，有助于核质成熟同步化，其相关机制有待进一步研究验证。

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