纳米铅在小鼠肝脏的吸收和代谢

王桂芳王黎辉①杨娜王吉顺①李清钊②

(河北省秦皇岛市出入境检验检疫局煤炭检测技术中心河北秦皇岛066003；①河北钢铁集团唐银公司；②华北理工大学公共卫生学院)

[摘要]①目的检测不同时间点可溶性及不可溶性纳米硫化铅在小鼠肝脏的代谢，探讨纳米铅的毒代动力学差异。②方法选择雄性昆明小鼠69只，体质量约20g。将小鼠随机分为3个组别，每组23只小鼠。分别为未包裹的不可溶性纳米硫化铅(PbSⅠ)、巯基乙酸包裹的可溶性纳米硫化铅(PbSⅡ)、巯基乙醇包裹的可性纳米硫化铅(PbSⅢ)3组。采用腹腔注射法进行一次性染毒。各染毒组分别注入相应浓度纳米PbS颗粒悬浮液0.4mL(按200mg/kg给药)。于染毒后第0.5、1、6、12、24、36、48h处死，取其肝脏。经消化后，用7500型电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测各组的肝中铅元素的含量。③结果随着小鼠腹腔染毒后时间的增加，肝样品中铅元素含量呈上升到一定峰值后逐渐降低的趋势。观察小鼠腹腔染毒后48小时内7个时间点的铅元素含量，3组肝样品中铅浓度存在以下关系：未包裹组>巯基乙酸组>巯基乙醇组。毒代动力学铅-时曲线符合一级吸收二室模型；毒代动力学参数显示，巯基乙醇组代谢最快，分布范围最广，而未包裹组代谢最慢，分布范围最广。④结论可溶性比不可溶性纳米硫化铅在肝中的含量低，代谢速度快。

[关键词]纳米硫化铅 电感耦合等离子体质谱仪 毒代动力学

[中图分类号]R 181[文献标识码]B

【作者简介】王桂芳，女(1963-)，工程师。主要研究方向：煤炭检测。

【通讯作者】李清钊。

纳米粒子是指粒子的晶体结构至少有一维处于在 0.1~100nm之间的材料，纳米粒子作为新型材料有广泛的用途，也对人体健康以及环境带来了潜在影响，国内外的科学界和政府部门已经广泛关注纳米的应用前景以及对健康的潜在影响[1]，自2000年以来，国内外对于纳米材料的生物安全性和毒理学问题也展开了日益深入的讨论和研究[2,3]。

本课题利用电感耦合等离子体质谱联用仪(ICP-MS)[4~6]检测不同时间点肝中铅的含量，为研究纳米硫化铅在体内代谢提供依据。

1对象与方法

1.1研究对象清洁级健康雄性小鼠69只，体质量约20g，购自：北京华阜康实验有限公司，动物号SCXK(京)2009-00041.2 主要试剂 PbSⅠ，未包裹的纳米PbS(粒径30nm)；PbSⅡ，巯基乙酸包裹的纳米PbS(粒径30nm)；PbSⅢ，巯基乙醇包裹的纳米PbS(粒径30nm)，由南开大学环境科学与工程学院提供。硝化液：浓硝酸、高氯酸(比例为4：1)。抗凝剂：肝素。

1.2主要器材电子天平、电热板、离心机、7500型电感耦合等离子体质谱联用仪(ICP-MS)(美国Agility公司产品)。

1.3方法

1.3.1动物的分组及染毒。实验开始前将小鼠进行1周的适应性饲养。随机分为3组，分别为PbSⅠ(纳米硫化铅)、PbSⅡ(巯基乙酸包裹的纳米硫化铅)、PbSⅢ(巯基乙醇包裹的纳米硫化铅)组3个组别，每组23只。塑料笼饲养，自由进食饮水，饲养室温度在22℃左右，环境干燥，通风良好。

1.3.1.1药物溶剂的配制。生理盐水配置成浓度10mg/mL的混浊液，经过充分的超声振荡使液体均匀。

1.3.1.2动物的染毒。按上述分组，每组分别一次性腹腔注射3种不同的纳米硫化铅约0.4mL(按200mg/kg给药)。

1.3.2毒代动力学实验和组织分布实验。于鼠腹腔注射染毒后第0.5、1、6、12、24、36、48h，每个时间点取6只小鼠，小鼠采血后，取其肝，纯净水洗净组织表面的残血, 用滤纸将水分吸干后，于冰箱中冷冻-20℃保存待测。用电子天平称重肝样品置于锥形瓶中，在其中加入消化液在电热板上进行消化至消化液变为无色且恰好蒸干。消化完毕冷却后，用10%的盐酸溶液定容至10mL，离心10min(2000r/min)，再用微量移液器吸取0.5mL稀释至5mL，用7500型电感耦合等离子发射体质谱仪(ICP-MS)进行铅的定量分析。

1.3.3ICP-MS仪的工作条件。本次实验用美国生产的7500型电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定肝中铅元素的含量，该仪器的主要参数：载气1.18L/min，辅助气1.14L/min，等离子气15.0L/min，等离子体发生器发射功率1400W，雾化器SCF，雾室温度2.5℃，内标液209Bi，溶液的进样速度1mL/min，进样时间1min，稀硝酸冲洗时间30s，超纯水冲洗时间30s。

1.3.4样品标准曲线。准确配制一系列标准溶液，使铅的浓度为1μg/mL、20μg/mL、60μg/mL、100μg/mL，上机进行测定，以强度为纵坐标，浓度(μg/mL)为横坐标，绘制样品的标准工作曲线(Pb标准溶液回归方程Y=3.701E-0.03X+8.871E-0.05，r=0.9999)。

1.3.5样品的测定。肝消化液测定条件同标准曲线，仪器自动打印出分析结果，根据肝脏质量计算出其中铅元素的浓度。

1.3.6统计学处理。一次腹腔给药后，测得不同时间点铅的肝中浓度数据，数据用3p97软件处理房室模型并计算药代动力学参数Ke(速率常数)、T1/2(半衰期Half life)、AUC(曲线下面积Area Under Curve)、V(分布容积)、CL(清除率Clearance)，然后用SPSS软件进行统计分析。

2结果

2.1方法学考察方法学考察包括建立方法的专属性、线性、最低检测限、回收率、精密度和稳定性[9]。经过方法学考察，所建立的方法专属性好，本方法灵敏度高，检出限为0.15μg/L。连续2d检测方法的日间精密度的相对标准偏差<5%，说明稳定性好，符合生物样品分析的要求。所作标准曲线r≥0.99。

表1　不同时间点的肝脏中 铅含量测定结果

由表1和图1可知，随着染毒时间的增加，PbSⅡ处理的鼠的肝脏中铅的浓度在1h达到峰值。PbSⅠ、PbSⅢ处理的鼠的肝脏中铅的浓度在6h达到峰值，随后铅元素含量呈逐渐降低的趋势。达到峰值时PbSⅠ处理组的铅的浓度最高，PbSⅢ处理组的铅的浓度最低。

注：图1　肝脏中铅元素的铅-时曲线(μg/g)

2.3动力学参数小鼠腹腔一次给药后肝脏毒代动力学参数，见表2。

2.4结果3个组别的肝中的铅元素浓度关系总体上是：未包裹组> 巯基乙酸组>巯基乙醇组。不可溶性纳米硫化铅比可溶性纳米硫化铅在肝中消除慢、代谢慢、停留时间长且含量高。可溶性纳米硫化铅中，巯基乙醇包裹的比巯基乙酸包裹的在肝中的代谢速度快、消除快、停留时间短、含量低。

3讨论

目前纳米粒子的毒性、安全性研究还处于起步阶段，纳米技术的发展需要健全、合理的规范，建立纳米材料的安全标准是亟待解决问题。硫化铅具有刺激性，急性中毒可引起恶心、头痛和呕吐，长期铅蓄积可引起记忆力减退以及慢性肝肾损害。进入机体组织中的铅,主要通过肝脏代谢，肾脏排泄[7]。同时肝脏、肾脏也是铅在体内蓄积的部位, 尤其是早期接触的铅主要蓄积于肾、肝等软组织中[7]，在人体中蓄积的半衰期达15年。本实验中，小鼠一次腹腔给药后，使用ICP-MS测得不同时间点铅元素在血液中浓度数据，并用3p97软件处理房室模型并计算毒代动力学参数。

表2　小鼠腹腔注射给药后肝脏的毒代动力学参数

注：与PbSⅠ相比，*P<0.01；与PbSⅡ相比，#P<0.01

实验结果显示,PbSⅠ、PbSⅡ、PbSⅢ，小鼠体内为一级二室模型，笔者用SPSS软件进行统计分析，根据所获得的毒代动力学参数经方差分析可知，PbSⅠ体内代谢的时间最长，提示PbSⅠ在体内消除慢、代谢慢、停留时间长，各组肝中铅元素的含量PbSⅠ>PbSⅡ>PbSⅢ。毒代动力学参数显示，用巯基乙酸和巯基乙醇修饰后的纳米PbS在体内代谢速度快，蓄积量低，纳米PbS通过表面的Pb-连接巯基，借助其外端的-COOH和-OH，具有良好的水溶性，并能与生物大分子结合。因而在血液及组织脏器中的代谢速率要比不可溶性纳米硒化镉要快，亲水效果越好代谢也越快，因为-OH的亲水效果好于-COOH，所以巯基乙醇包裹后的代谢效果好于巯基乙酸，没有包裹的纳米硒化镉在小鼠体内代谢慢，且肝靶向明显。资料显示巯基对于铅急性中毒具有解毒作用，研究发现，铅染毒后立即给巯基，BAL(一种限制性内切酶)能显著降低小鼠肝中铅的含量，提高急性铅染毒小鼠的存活率[8]。因而不可溶性纳米材料较可溶性纳米材料急性毒性大，本实验也印证了这一结论。综上所述，用巯基包裹的纳米硫化铅的毒性要远远低于纳米硫化铅的毒性。本结果为减少纳米材料的毒性，为纳米硫化铅的安全使用提供科学数据和理论依据。

参考文献

[1]汪冰，丰伟悦，赵宇亮，等.纳米材料生物效应及其毒理学研究进展[J].中国科学B辑：化学，2005，35：1-10

[2]贾光，郑玉新.充分认识纳米材料安全性研究的重要意义[J].中华预防医学杂志，2007，41(1)：83-84

[3]刘扬，高愈希，吴刚，等.典型纳米材料生物效应及其毒理学研究的进展[J].中华预防医学杂志，2007，41(2)：130-133

[4]张建平, 庄峙厦 , 陈成祥 ,等.大鼠体内铅镉分布的稳定同位素示踪ICP -MS研究[J].分析测试学报,2008，27(8)：835-838

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[6]李永芳, 侯晓燕. 微波消解测定人发中五种微量元素的研究[A]. 新世纪预防医学面临的挑战--中华预防医学会首届学术年会论文摘要集[C], 2002

[7]陈敏,谢吉民,高晓钦.铅对小鼠肝肾毒作用的机理探讨[J]. 镇江医学院学报, 2000,10(4):620

[8]智绪平,金亚平,于飞,等.二巯基丁二酸和钙、维生素C联合应用对铅中毒小鼠体内铅水平的影响[J]. 卫生研究, 2006,35(5)：639

(2015-04-28收稿)(王一伊编辑)