金莲花药渣发酵物体外增强氟康唑抗白念珠菌作用的影响

姬建秀姜妍①韩淑英②

(河北省唐山市协和医院河北唐山063000；①华北理工大学冀唐学院；②基础医学院)

[摘要]①目的观察金莲花药渣发酵提取物(EGRF)对氟康唑抗白念珠菌作用的影响。②方法药物以倍比稀释，用试管法和平皿法测定氟康唑、EGRF及氟康唑+EGRF对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。③结果氟康唑和EGRF对白念珠菌的MIC为0.125mg/mL和1.25mg/mL，MBC为0.25mg/mL和2.5mg/mL；二者合用的MIC和MBC为(0.004+0.020)mg/mL和(0.008+0.040)mg/mL，氟康唑合用与单用MIC和MBC的效价比均为1：31.25；EGRF合用与单用MIC和MBC的效价比均为1：62.5。④结论EGRF对氟康唑抗白念珠菌有明显的增强作用。

[关键词]金莲花药渣氟康唑发酵物白色念珠菌

[中图分类号]R 29[文献标识码]A

【基金项目】唐山市“十二五”重点科技支撑项目(编号：10130203-3)。

【作者简介】姬建秀(1981-)，女，主治医师。研究方向：阴道炎的药物治疗。

【通讯作者】韩淑英。

白念珠菌为人体常见条件致病菌，由白念珠菌引起的感染仍是目前最常见的机会性真菌感染[1]。临床对念珠菌感染主要应用氟康唑(fluconazole，FLC)治疗，但随着氟康唑的大量应用，逐渐出现了氟康唑的耐药菌株，导致其疗效降低或无效[2,3]。因此，寻找降低白念珠菌的抗药性药物及能增加FLC疗效的药物或方法非常必要。相关学者前期研究发现，金莲花药渣发酵提取物能增加小鼠免疫功能并具有抗真菌作用[4~6]。本研究应用金莲花药渣发酵物观察了体外抗白念珠菌的作用，并考察了与氟康唑联合应用对其作用的影响，报告如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1受试药物。金莲花药渣发酵提取物(extraction of globeflower residue fermentation, EGRF)制备：将金莲花药渣[河北(唐山)百善药业有限公司生产金莲花胶囊后的残渣]干燥、粉碎后，按一定比例加入增殖活化的安琪酵母菌，并给予酵母菌生长所需营养成分。在37℃培养72h后，加入无水乙醇使乙醇浓度达70%。70℃水浴提取2次，2h/次，收到过滤，合并提取液，回收乙醇，将回收乙醇后的提取液70℃水浴干燥，即得金莲花药渣发酵提取物(EGRF)。

1.1.2主要药品、试剂。安琪酵母菌(来源于新疆伊宁市安琪酵母有限公司)；氟康唑氯化钠注射液(批号：1109184A，安徽双鹤药业有限责任公司)；沙氏培养基(SDA 培养基)(北京博星生物技术有限责任公司，批号：20110826)；营养肉汤:(北京博星生物技术有限责任公司，批号：20100730)。

1.1.3实验菌株。白色念珠菌临床新分离菌株，由河北省唐山市开滦总医院检验科提供，放4℃冰箱保存。白色念珠菌的临床分离菌株经2次沙堡氏培养基活化(培养温度为37℃)，挑取新培养24h的白色念珠菌菌落混悬于磷酸缓冲盐溶液(PBS)液中，震荡使之充分混匀，应用血细胞计数板调节浓度至107cfu/mL(cfu:菌落形成单位)，现配现用。

1.1.4实验仪器。SFG-02.500型电热鼓风干燥箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司)， 血细胞计数板(上海达明试验仪器有限公司)，FA2104N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)，显微镜(常州锐品精密仪器有限公司)，生物安全柜(Thermo scientific)，高压灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，PYX-DH280型电热恒温培养箱(上海玺恒实业有限公司)。

1.2方法

1.2.1受试药物配制。金莲花药渣发酵提取物(EGRF)：取金莲花药渣发酵提取物于乳钵中充分研磨后称100mg，溶解于10mL营养肉汤中，得浓度10mg/mL的药液，安全柜下用0.45μm微孔滤膜过滤，4℃冰箱保存备用；氟康唑与EGRF混合液：取上述EGRF液与氟康唑氯化钠原液(2mg/mL)按1:1混合(临用前配制)。

1.2.2菌悬液的制备。将平板上培养24h的活化白念珠菌挑取菌落混悬于营养肉汤中，震荡使之充分混匀，应用血细胞计数板调节菌悬液浓度至100万个/mL。

1.2.3MIC和MBC的测定。每一药液挑选10支,无菌中号试管编号1～10，先无菌加入1.0mL肉汤至第1～9管内；药液采用2倍连续稀释法，加1.0mL供试药液至第1管，将第1管混合后取1.0mL至第2管，依次至第8管，再从第8管取1.0mL丢去；第9管加入供试药液1.0mL，不加菌作阴性对照，第10管只加菌液；第1～8管分别加入已准备好的1mL经稀释(含菌量约100万个/mL)的新鲜菌液，置37℃培养箱内培养24h后观察有无细菌生长，并记录。肉眼观察有无混浊，混浊为生长阳性，澄清为阴性。以肉眼观察，药物最低浓度管无菌生长者，即为受试药的MIC。将各药物试管摇匀后用加样器取10μL放到沙堡氏琼脂平皿上，用白金耳划线接种，培养48小时后观察有否菌落生长。沙堡氏琼脂平板上无菌生长，其含药浓度最低的1管，即为最低杀菌浓度(MBC)。

2结果

表1显示，白色念珠菌对照管明显混浊，有大量念珠菌落生长；不加菌的阴性对照清亮透明，无菌生长。随着各管药浓度的降低，对白色念珠菌的抑杀作用也降低。氟康唑和EGRF单独应用对白念珠菌的MIC为0.125 mg/mL和1.25mg/mL，MBC为0.25 mg/mL和2.5 mg/mL；而二者联合应用的MIC和MBC分别为(0.004+0.020)mg/mL和(0.008+0.040)mg/mL，氟康唑联合用药与单用药的效价比MIC和MBC均为1：31.25；EGRF联合用药与单用药的效价比MIC和MBC均为1：62.5，见表1。

表1　EGRF对氟康唑抗白念珠菌MIC、MBC的影响(mg/mL)

注：MIC： -无混浊，+略混浊，2+较混浊，3+明显混浊;MBC：-：无菌落；+：1～10个菌落；2+：21~30菌落；3+：多于31个菌落

3讨论

念珠菌感染可引起皮肤、黏膜、指甲及深部组织念珠菌病，临床主要应用唑类抗真菌药，如氟康唑、咪康唑、酮康唑、伊曲康唑等[7]。随着唑类抗真菌药广泛长期应用，白念珠菌抗药性日趋严重，给念珠菌病的治疗带来严峻的挑战。联合用药可以减少药物用量，增强药效，降低药物不良反应，同时可避免耐药性的发生[8]。实验结果显示：氟康唑和EGRF单独应用对白念珠菌的MIC为0.125mg/mL和1.25mg/mL，MBC为0.25mg/mL和2.5mg/mL；而二者联合应用的MIC和MBC分别为(0.004+0.020)mg/mL和(0.008+0.040)mg/mL，氟康唑联合用药与单用药的效价比MIC和MBC均为1：31.25，表明氟康唑与EGRF联合应用，达到同等效应时氟康唑用量降低了31倍；EGRF联合用药与单用药的效价比MIC和MBC均为1：62.5，达到同等效应时EGRF用量降低了62倍。研究结果表明，两者联合应用对白念珠菌的抑杀作用均明显强于各自单独应用，二者具有协同和增强作用。

金莲花(Trollius chinensis Bunge)是毛茛科植物，属药食两用品种，有着悠久的药用史。金莲花含丰富的黄酮类成分，具有抗细菌、抗病毒、抗氧化等多种药理作用[9~11]。临床主要用于感冒、发热、扁桃体炎、咽炎、尿路感染等的治疗[12]，但有关金莲花抗真菌作用未见文献报道。前期研究发现，金莲花药渣及发酵提取物可增强正常小鼠及免疫功能低下小鼠抗应激反应能力和免疫功能，并具有抗真菌作用(授权国家发明专利)[4,5]。本研究表明，金莲花药渣中某些成分，经过酵母菌代谢、转化后产生了新的活性成分，这些新的化合物中的某些成分可能对真菌有抑制或杀灭作用，并能够增加氟康唑的抗菌活性，从而产生新的药理作用，具体是什么活性成分值得深入研究。我国每年有大量中药渣产生，多数被废弃掉，不仅污染环境，而且中药资源浪费很大。因此，如何将中药渣充分利用，变废为宝，意义深远。

参考文献

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(2015-06-25收稿)(王一伊编辑)