■李龙飞 汉丽梅 李一帆 T.Rabie

（1.沈阳农业大学，辽宁沈阳 110161；2.Suez Canal University，Faculty of Agriculture Ismailia,Egypt）

样品的采集和DNA的提取是科学研究中重要的技术之一，特别是对于一些取样比较困难的研究对象，如稀有的动物或保护类动物，常用的取样方法有3种，即伤害性取样、非伤害性取样和非损伤性取样[1]。伤害性取样即通过杀死动物而获得新鲜的肌肉、肝脏和血液等组织样品；非伤害性取样是通过捕获动物来抽取血液、采集毛发或羽毛、耳、尾、趾等样品；非损伤性取样法即在不触及或伤害动物本身的情况下，通过收集脱落的毛发或羽毛、粪便、尿液、食物残渣、鹿角、鱼鳞和卵壳等不同形式的样品进行遗传分析的一种取样方法[2]。自1975年Bradfied等成功地从头发中提取DNA以来，毛发已成为法医学、遗传学常用的检测材料之一[3]，它具有无创伤性、取材痛苦小、运输和储存方便、可靠、重复性高等优点[4]。粪便样品中含有大量的食物残渣及各种消化道成分，因此粪便中提取DNA要比血液和组织中困难得多,所以此法仅用于濒危动物[5]。

目前，鸡的DNA提取多采用血液样品，而对于羽毛样品基因组DNA提取少见详细报道。本研究通过对血液、肝脏和羽毛不同部位的样品进行不同程序的处理，并对提取基因组DNA进行了应用效果的分析，获得了有效且伤害性小的方案，可用于提取高质量的基因组DNA，为禽类分子生物学方面的研究提供更广阔的样本来源和技术方法。

1 材料与方法

1.1 试验动物

1.2 试剂与仪器

1.2.1 仪器

日立U-1800紫外可见分光光度计（日本日立公司）、Tanon EPS300电泳仪（上海天能科技有限公司）、专业数码凝胶成像与分析系统（江苏省捷达科技发展有限公司）。

1.2.2 试剂

Biospin组织基因组DNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）、λ-HindⅢ、50 bp DNA Ladder Marker、pH7.4的PBS、DTT、CHAPS细胞裂解液、无水乙醇、TAE缓冲液、琼脂糖、EB、去离子水、双蒸水等。

1.2.3 检测引物

上游：5’-GCTCTCATAGAAGAGTCAGG-3’；

下游：5’-CATGAGACTAGTGCCTGTCA-3’。

1.3 方法

1.3.1 取样

利用涵盖的内容，汉语言文学专业使得学生语言知识更加丰富，增强与人沟通，思维获得理性发展，从而有效品鉴文学作品。学生只有具备这一方面的综合能力，才能准确掌握汉语言应用语境，以此增强自身语文综合素养。

新鲜肝脏、血液、羽毛。羽毛的取样部位分别为羽髓、羽鞘、羽根、实心羽茎和羽毛上脐周围绒羽，具体位置见图1。

图1 羽毛的不同取样部位

1.3.2 样品前处理

取血液50 μl于1.5 ml离心管；取肝脏50 mg加500 μl pH值7.4的PBS缓冲液充分研磨后移至1.5 ml离心管；羽毛样品经乙醇清洗后，取羽髓3根加500 μl pH值7.4的PBS充分研磨后移至1.5 ml离心管；将挤出羽髓的羽毛用无水乙醇浸泡、清洗，重复3次，干燥后待用；分别取羽鞘3根（0.5 cm）剪碎放入两支1.5 ml离心管备用；分别取羽根3根（0.3 cm）剪碎放入两支1.5 ml离心管备用；分别取实心羽茎3根（1 cm）剪碎放入两支1.5 ml离心管备用；分别取羽毛上脐周围绒羽1根剪碎放入两支1.5 ml离心管备用。取蒸馏水50 μl至离心管，做阴性对照。羽鞘、实心羽茎和羽毛上脐周围绒羽在消化前，做两种处理，其中一组加入10 μl 1 mol/l DTT。以CHAPS细胞裂解液进行样品消化，血液和阴性对照管消化20 min，肝脏和羽髓消化2.5 h，羽鞘、羽根、实心羽茎和上脐周围绒羽过夜消化。

1.3.3 DNA的提取

采用Biospin组织基因组DNA提取试剂盒，对上述样本提取基因组DNA，4℃冰箱保存备用。

1.3.4 对提取的DNA进行检测

将DNA提取液用1%琼脂糖凝胶电泳检测，120 V、30 min。将提取的DNA分别用PCR法进行检测。反应体系：12 μl，含Go Taq Green Master Mix 6 μl，上下游引物混合液1 μl，DNA模板50 ng/μl（阴性对照中将DNA模板用无RNA酶水代替）。扩增程序为：先预变性95℃，5 min，再95℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，120 V、30 min。

2 结果与分析

2.1 不同样品鸡基因组DNA提取结果分析

提取的基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳后，肝脏、血液、羽髓提取的DNA电泳条带清晰，羽鞘提取DNA的电泳条带微弱，其余样本观察不到电泳条带（见图2）。

图2 不同样品基因组DNA的电泳结果

2.2 PCR检测不同样品的基因组DNA提取效果

经PCR扩增电泳检测，肝脏、血液、羽髓、羽鞘、羽根、实心羽茎、绒羽中提取的基因组DNA，PCR产物电泳条带清晰，说明各不同样品，经预处理均可提取到一定量的基因组DNA，可以用于PCR扩增反应。

2.3 基因组DNA提取条件的优化结果

羽毛预处理，经无水乙醇清洗羽毛样品，可以更有效去除杂质与污物，有利于基因组DNA的提取。不同样品消化时间的分析结果表明，肝脏和羽髓消化20 min时仍有大量未被裂解的组织，消化2.5 h才可完全裂解；羽鞘、羽根、实心羽茎和绒羽需过夜才可消化完全。足够的消化时间条件下，DTT加入，对所提取的DNA的质量并无明显影响。

研究结果表明，肝脏、血液、羽髓提取基因组DNA效果好，是理想的基因组DNA提取的样本，羽鞘、羽根、实心羽茎、绒羽，可提取到一定量的基因组DNA，虽然没有肝脏、血液、羽髓多，但经过适当的提取条件的优化，可以提取到基因组DNA，并足以用于PCR反应（见图3）。

图3 不同样品基因组DNA PCR产物的电泳结果

3 讨论

动物DNA的提取多以肝脏为原料，肝脏是可以不断产生新细胞的器官，很多细胞处在分裂期，这时的DNA呈现出高度螺旋的状态，微量采样就可以提取出大量的DNA。但由于肝脏提取DNA需要杀死试验动物，伤害性较大，大量采样时不适合用该法，研究濒危动物时更不能用此法。

研究结果显示血液所提出的DNA与肝脏提出的DNA的量相差无几，足以满足各种涉及PCR反应的分子生物学试验。禽类血液中除了白细胞具有细胞核外，红细胞也有细胞核，并且禽类没有血小板，含有一种与血小板具有同样功能的凝血细胞，该凝血细胞也具有细胞核。从而，禽类可以通过微量的血液提取出较多的DNA。取50 μl血液不会给禽类带来伤害，因此，对于禽类，这种非伤害性取样可以根据需要予以推广应用，但不宜用于研究濒危动物。

羽毛的5个部位：羽髓、羽鞘、羽根、羽茎和绒羽都可以提出一定纯度的DNA，羽鞘、羽根、羽茎和绒羽中取DNA的量虽然没有羽髓多，但是都可用于PCR反应。有文献指出，加入DTT可破坏角蛋白结构中的二硫键，使消化更完全，更利于提取DNA[6]。本试验表明，足够的消化时间下，加入DTT和不加DTT所提取的DNA的量并无明显差别。

羽髓为机体组织，含有大量成熟细胞，可以提取出一定量的DNA，因此，是很好的DNA提取样本[7]。羽鞘本身虽然可能高度角质化，但其内壁会附着一定量的髓质，含有一定量的DNA。羽根中可能附带有一定量的组织，所以也可能含有DNA。羽根含有组织细胞的多少依据羽毛的收集方式是捡取脱落羽毛（非损伤性取样）还是拔取羽毛。拔取羽毛的羽根通常比脱落羽毛的羽根含的DNA丰富[8]。脱落的羽毛跟脱落的毛发一样，作为一种非损伤的样品，其所能提供的DNA受毛根部毛囊残留的情况影响，毛囊保存的越是完整，所提取的DNA也就越多[9]。采用羽毛作为DNA提取原料,可以简化鸟类提取基因组DNA的方法，特别是当取血液样本困难时，这种方法效果更加明显[10]。以羽毛为样本提取DNA虽然提取的量小，但是对禽类的伤害降到最低，适于濒危禽类的研究。

在研究中选择样品，可以以快速有效且伤害性小为原则，根据具体条件选择合适的样本进行DNA的提取。本研究结果为禽类的分子生物学研究增加了更广阔的样本来源。