■高肖微 齐遵利 张秀文

（河北农业大学海洋学院，河北秦皇岛 066003）

在饲料中添加抗生素对水产动物的生长和疾病预防有一定的促进作用，但同时也会导致耐药菌株的产生，破坏动物体内微生态平衡，使动物体非特异性免疫能力下降[1-2]。近几年人们一直在寻找抗生素的替代品，地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）具有促进肠道内厌氧菌的生长、抑制致病菌的生长繁殖、调整肠道菌群平衡和促进食物消化吸收的作用，并且满足耐高温、耐酸碱等饲料加工特性，具有无残留、无毒副作用，避免了使用抗生素的一些弊端。研究地衣芽孢杆菌作为饲料添加剂的使用越来越引起人们的重视。本试验在鲤鱼饲料中添加地衣芽孢杆菌，探讨其对鲤鱼生长性能、非特异性免疫酶活性的影响，为地衣芽孢杆菌在鲤鱼养殖中的应用提供依据。

1 试验材料

试验用鲤鱼来自天津市换新水产良种场。试验鱼先暂养2周。暂养期间，投喂饲料为基础饲料，以鲤鱼出现有规律摄食为驯化指标。试验用地衣芽孢杆菌来自江苏纳克生物工程有限公司，活菌数为3×1010cfu/g。

2 方法

2.1 试验设计与管理

试验在110 cm×45 cm×60 cm的水族箱内进行。将地衣芽孢杆菌按照0%（对照组）、0.05%（A1）、0.1%（A2）、0.2%（A3）的比例加入到基础饲料中制成试验饲料，每组3个平行，每个水族箱内放20尾试验鱼。每天08:30、12:30和16:30定时投喂，投喂量约为体重的3%。每天检查鲤鱼的摄食、发病或死亡情况，做好记录。水温控制在25℃左右，根据水质情况适当换水，每次换水量为1/5。连续投喂60 d。

2.2 生长指标的测定

试验正式开始后，分别测定对照组和试验组的鲤鱼初始体重，饲喂60 d后，停食1 d，空腹测定终末体重。计算各组鱼的相对增重率和饲料系数。

饲料系数（CF）=饲料消耗量/鱼的增重量；

相对增重率（%）=（试验末鱼平均尾重量－试验初鱼平均尾重量）/试验初鱼平均尾重量×100。

2.3 生化指标的测定

试验开始后在20、40、60 d，从每个试验处理组随机取3尾鱼，用肝素钠水溶液润洗过的一次性注射器在鱼的尾静脉采血2 ml，立即轻轻摇匀，置于4℃冰箱内保存。3 000 r/min冷冻离心10 min后，提取血清。24 h内测定完毕。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LZM）、谷草转氨酶（GOT）的活性均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，1个SOD活性单位（U）定义：1 ml血清反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为1个活性单位；溶菌酶（LZM）的活性：在温度为37℃、波长为530 nm下，1 min内引起吸光度下降0.001为1个活性单位；过氧化氢酶（CAT）的活性定义为：1 ml血清或血浆1 s分解1 μmol的H2O2的量为1个活性单位（U）；碱性磷酸酶（AKP）活性单位的定义：100 ml血清在37℃与基质作用15 min时产生1 mg酚为1个金氏单位；酸性磷酸酶（ACP）的活性：100 ml血清在37℃与基质作用15 min时产生1 mg酚为1个金氏单位；谷草转氨酶（GOT）活性采用比色法测定，以绝对OD值，查标准曲线，求得相应的GOT活性单位。

2.4 数据处理

采用SPSS17.0进行数据处理，运用ANOVA单因素方差分析及Duncan's多重比较法对试验结果进行显著性检验，试验结果用“平均值±标准差（mean±SD）”表示，显著水平为P＜0.05。

3 结果与分析

3.1 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲤鱼生长性能的影响（见表1）

表1 地衣芽孢杆菌对鲤鱼生长性能的影响

由表1可知，与对照组相比，鲤鱼的生长性能显著增强（P＜0.05），其中0.1%组效果最好，相对增重率和饲料系数分别为156.57%、1.58，且显著高于A1和A3组（P＜0.05），A1与A3组之间差异不显著（P＞0.05）。

3.2 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲤鱼生化指标的影响（见表2及图1、图2）

3.2.1 对SOD的影响

由表2可知，投喂20 d：地衣芽孢杆菌能显著提高鲤鱼SOD活性（P＜0.05），3个试验组较对照组分别提高29.53%、55.5%、47.84%。与A1组相比，A2、A3组显著提高了鲤鱼抗氧化能力（P＜0.05）；投喂 40 d：试验组SOD活性与对照组相比较差异显著（P＜0.05），试验组之间差异显著（P＜0.05），A2组SOD活性最高，较对照组高出61.67 U/ml；投喂60 d：3个试验组之间差异不显著（P＞0.05），但是同对照组有显著性差异（P＜0.05）。

3.2.2 对LZM的影响

表2 地衣芽孢杆菌对鲤鱼血清SOD、LZM、CAT活性的影响（U/ml）

图1 地衣芽孢杆菌对鲤鱼血清ACP和AKP活性的影响

图2 地衣芽孢杆菌对鲤鱼血清GOT活性的影响

由表2可知，投喂20 d：地衣芽孢杆菌对鲤鱼LZM影响较小（P＞0.05）；投喂40 d：3个试验组的LZM活性与对照组相比差异显著（P＜0.05），较对照组提高28.67%、31.96%、33.29%，试验组之间差异不显著（P＞0.05），添加0.2%地衣芽孢杆菌组效果较好；投喂60 d：试验组同对照组差异显著（P＜0.05），A1与A3差异不显著（P＞0.05），与A2有显著差异 （P＜0.05）。A2组LZM活性达到最高，为88.83 U/ml，较对照组提高39.87%。

3.2.3 对CAT的影响

由表2可知，整个试验期间各个试验组CAT呈现增高的趋势。投喂20 d：试验组与对照组差异显著（P＜0.05），其中A1和A2组CAT活性差异不显著（P＞0.05），均与A3组CAT活性差异显著（P＜0.05）；投喂40 d：3个试验组的CAT活性和对照组相比差异显著（P＜0.05），A2、A3组CAT活性差异不显著（P＞0.05）。投喂60 d：4个组之间CAT活性差异显著（P＜0.05）。A3组CAT活性达到最高，为5.87 U/ml，相比对照组增加了86.35%。

3.2.4 对ACP和AKP的影响

由图1可知，对照组和试验组鲤鱼的ACP和AKP活性，随着投喂时间的增加稍微有所增强。ACP活性：投喂20 d，试验组和对照组ACP活性差异显著（P＜0.05），A1和 A3差异不显著（P＞0.05），与 A2差异显著（P＜0.05）；投喂40 d和60 d效果相同，试验组之间差异不显著（P＞0.05），但同对照组相比差异显著（P＜0.05）。AKP活性：投喂20 d和40 d试验组和对照组AKP活性差异显著（P＜0.05），A1和A3差异不显著（P＞0.05），与A2差异显著（P＜0.05）；投喂60 d，试验组之间差异不显著（P＞0.05），但同对照组相比差异显著（P＜0.05）。

3.2.5 对GOT的影响

由图2可知，整个试验期间随着投喂地衣芽孢杆菌饲料时间的增加，试验组和对照组的GOT活性稍有降低或升高，但没有显著差异（P＞0.05）。投喂地衣芽孢杆菌20 d时，与对照组相比，除A3组外，A1与A2组稍有升高；40、60 d后，试验组GOT活性呈降低趋势。

4 讨论

4.1 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲤鱼生长的影响

从表1可以看出，地衣芽孢杆菌添加剂能够降低饲料系数，提高试验组鲤鱼相对增重率。地衣芽孢杆菌随添加量增加，增重率呈现先增加，而后略有降低的趋势；饲料系数先降低，然后升高。其中添加地衣芽孢杆菌0.1%（A2），增重率最大，饲料系数最低。这一结果与刘波等[3]研究地衣芽孢杆菌对异育银鲫生长的影响和华雪铭等[4]研究饲料添加芽孢杆菌对异育银鲫的生长及抗病力的影响所得结果相似。这可能是地衣芽孢杆菌进入肠道后产生了多肽、维生素、氨基酸等多种营养物质，同时产生蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、纤维素酶等[5]，这些酶进入宿主肠道后，增加宿主内源酶数量和消化酶活性，使动物肠道褶皱增多，增强肠黏膜细胞吸收能力[6]，维持和调节鱼体肠道菌群平衡，减少降解胆酸的细菌数量[7-8]，从而促进动物生长。

4.2 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲤鱼非特异性免疫的影响

本试验结果显示，在饲料中添加0.05%～0.2%地衣芽孢杆菌可以显著提高ACP和AKP活性（P＜0.05），且20 d时A2组ACP、AKP活性显著高于A1和A3组（P＜0.05），40 d时A2组AKP活性显著高于A1和A3组（P＜0.05），说明在饲料中添加地衣芽孢杆菌可以提高鲤鱼免疫力，其中以0.1%添加组效果最好。谷草转氨酶（GOT）的活性试验组与对照组没有显著差异（P＞0.05），说明试验采样鲤鱼的肝胰脏等组织没有发生病变[9]，避免了在鱼患病时取样，从而引起非试验条件的生化指标的差别，也说明在试验期间对鲤鱼肝胰脏未造成明显损伤。

有学者研究发现：用添加枯草芽孢杆菌的饲料投喂鲤鱼，可以促进鲤鱼免疫器官的成熟，增加鲤鱼的巨噬细胞呼吸爆发活性和抗嗜水气单胞菌的能力[10]。鱼虾等生物在抵抗外来入侵病菌或条件致病菌时，其非特异性免疫在清除异物时发挥着重要作用。研究表明凡纳滨对虾SOD具有免疫调节活性，可以用来评价机体免疫能力高低[11]。芽孢杆菌添加到一定量时，南美白对虾的SOD等免疫指标比对照组提高几倍[12]。

本试验通过投喂不同剂量的地衣芽孢杆菌饲料发现：投喂20 d时，地衣芽孢杆菌能显著提高鲤鱼SOD、CAT活性（P＜0.05），分别比对照组提高29.53%、55.5%、47.84%和33.75%、46.25%、62.08%。而对LZM影响较小（P＞0.05）；投喂40 d：SOD、CAT、LZM活性显著高于对照组（P＜0.05），A2组SOD最高，为168.38 U/ml，A3组CAT和LZM活性最高，分别为4.79 U/ml和82.28 U/ml。投喂60 d时，随着地衣芽孢杆菌添加量的增加，鲤鱼免疫机能不同程度显著提高（P＜0.05）。

本试验中试验组鲤鱼血清生化指标的变化，同地衣芽孢杆菌对三角帆蚌免疫机能的影响[13]和Harikrishnan等[14]研究芽孢杆菌对牙鲆免疫机能影响，以及沈文英等[15]研究饲料中添加枯草芽孢杆菌对草鱼免疫功能的影响所报道的结果相似，表现为血清中溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性均显著高于对照组，表明芽孢杆菌对鲤鱼体液免疫因子产生明显影响，有利于增强鲤鱼抗病力。本试验通过向饲料中添加地衣芽孢杆菌，显著增加了血清中溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性。说明在基础饲料中添加不同剂量的地衣芽孢杆菌能提高鲤鱼的免疫力和抗病力，其中添加0.1%（A2组）就可以最大降低饲料系数，提高增重率，同时增加鲤鱼的免疫能力。

对于地衣芽孢杆菌对鲤鱼生长和免疫的影响机制，需要进一步做组织学和基因组学研究。