金子鑫 杨瑞金，2 朱生博 刘新娟 张文斌，2

（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；3.杭州九阳小家电有限公司，浙江 杭州 310000）

豆浆作为传统食品，在亚洲多数地区消费广泛，因其含有丰富的蛋白质、矿物元素、维生素以及卵磷脂、异黄酮等功能性成分［1］，成为 “乳糖不耐症”人群的良好牛奶替代品。长期以来，豆浆一直在中国人的早餐中占有重要的一席之地。从1994年九阳公司发明第一台家用豆浆机以来，豆浆机逐渐走进千家万户，经过20年的发展，家用豆浆机的功能和程序得到了不断的改进和提升，为人们带来了自制丰富多彩、方便健康的豆浆食品的乐趣。

大豆发芽不仅可使脂肪氧合酶、胰蛋白酶抑制剂、植酸等抗营养因子的水平降低，同时还可使水溶性维生素、氨基酸、大豆异黄酮、γ－氨基丁酸（GABA）等物质富集［2］而大大提高其营养价值。GABA是一种非蛋白质氨基酸，广泛分布于动植物体内，具有降血压、降血糖、抗抑郁、安定精神、改善更年期综合症等多种生理功能［3］。近些年，随着GABA的生理功能不断被证实，GABA的富集、生产和应用成为新的热点。2009年，卫生部批准GABA为新资源食品，可用于食品的生产加工。大豆在发芽过程中内源谷氨酸脱羧酶（GAD）被激活利用生物体的内源谷氨酸脱羧酶的脱羧作用将谷氨酸（L－Glu）转化为 GABA［4］，使 GABA 得到富集。氨基酸不仅是蛋白质的基本组成单位，而且其本身具有促进胰岛素分泌、作用于消化和神经系统、提高机体免疫功能及解毒功能等特殊的生理功能［5］。蛋白质或多肽经水解成小分子的氨基酸和寡肽后，才被人体小肠黏膜所吸收，更易为机体所利用［6，7］。大豆中胰蛋白酶抑制剂有 Kunitz型（KSTI）和Bowman－Birk型（BBI）两种。大豆在发芽过程中，由于蛋白酶水解作用，KSTI和BBI两种胰蛋白酶抑制剂含量均有所下降［8］。其中，KSTI型较容易失活，pH 7的体系中，100 ℃加热1min即可将其灭活到10%以下，而较难灭活的BBI型，100℃加热360min仍可存活80%左右［9］。

目前中国对胚芽豆浆的煮浆工艺研究较少，且市面上尚无针对发芽大豆为原料制作胚芽豆浆的豆浆机程序。本试验利用九阳工装机平台（经改装后可调整豆浆机制浆工艺的豆浆机），拟研究不同制浆工艺条件下游离氨基酸、γ－氨基丁酸、胰蛋白酶抑制剂的变化，从而优化出最佳胚芽豆浆程序，并在此基础上对胚芽豆浆和干豆豆浆上述考察指标进行对比，以期为豆浆机新程序开发和胚芽豆浆加工工艺提供一定参考，也为普通家庭用户提供更为丰富的食谱选择。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

大豆：品种中黄57，收获于2012年秋；

N－苯甲酰－DL－精氨酸－对硝基苯胺盐酸盐（BAPNA）：纯度98%，美国Sigma－Aldrich公司；

胰蛋白酶：酶活≥10 000BAEE U/mg，美国 Sigma－Aldrich公司；

氯化钙、盐酸、三羟甲基氨基甲烷、乙酸、二甲基亚砜、三氯乙酸等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

豆浆机：D58SG型，杭州九阳小家电有限公司；

豆浆机工装平台：D58SG型，杭州九阳小家电有限公司；

豆芽机：DYJ－S6365型，广东小熊电器有限公司；

数显电热恒温水浴锅：HH－2型，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；

分析天平：MA110型，上海第二天平仪器厂；

紫外—可见分光光度计：722型，尤尼柯上海仪器有限公司；

高效液相色谱仪：Ag1100型，美国安捷伦公司；

冷冻离心机：Allegra25R型，美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 不同豆浆的制作工艺

（1）胚芽豆浆：称取85g无虫害、健康、颗粒饱满的大豆，清水冲洗去除表面杂质和灰尘，然后用去离子水冲洗。于3倍体积水中浸泡6h，后于豆芽机（24±3℃）中发芽16h后取出。加水至1 100g，于D58SG豆浆机或工装机平台中制作豆浆，过30目滤网后取样测定各项指标。

（2）干豆豆浆：将85g大豆清洗后，加水至1 100g，用D58SG程序直接制作豆浆，完成后过30目滤网并取样测定各项指标。

1.4 胚芽豆浆制作的单因素试验设计

（1）粉碎温度：在豆浆机程序基础上，调整粉碎温度分别为50，60，70，80，90℃，其他参数保持不变，在工装平台上运行新程序，豆浆制作完成后过滤取样，测定γ－氨基丁酸、胰蛋白酶抑制剂、游离氨基酸。

（2）煮浆时间：在豆浆机程序基础上，调整煮浆时间分别为2，3，4，6，8min，其他参数保持不变，在工装平台上运行新程序，豆浆制作完成后过滤取样，测定γ－氨基丁酸、胰蛋白酶抑制剂、游离氨基酸。

1.5 γ－氨基丁酸及游离氨基酸含量的测定

（1）γ－氨基丁酸（GABA）及游离氨基酸的提取：称取10 g左右豆浆加入10mL的10%三氯乙酸，用5%三氯乙酸定容至25mL；超声提取30min；后用双层滤纸过滤，将滤液以10 000r/min离心10min，取上清液用于测定。

（2）测定方法：邻苯二甲醛—氯甲酸芴甲酯（OPA—FMOC）柱前衍生化。色谱柱：ODS HYPERSIL（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：40℃；流动相A相：称取8.0g结晶乙酸钠于烧杯中，加1 000mL水搅拌至所有结晶水溶解，再加入225mL三乙胺，搅拌并滴加5%的醋酸，将pH调到7.20±0.05，加入5mL四氢呋喃，混合后备用；流动相B相：称取8.0g结晶乙酸钠于烧杯中，加入400mL水搅拌至所有结晶溶解，滴加5% 醋酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入800mL乙腈和800mL甲醇，混合后备用；紫外检测器：发射波长338nm，激发波长262nm；梯度洗脱程序见表1。

表1 高效液相分析γ－氨基丁酸所用梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedures for HPLC analysis ofγ－aminobutyric acid

1.6 胰蛋白酶抑制剂活性的测定

参考王韧［10］报道的方法并作微调，具体如下：

（1）试剂配制：① 酶液的配制：0.02mg/mL胰蛋白酶液，称取4mg胰蛋白酶，溶解于0.001mol/L盐酸中，定容至200mL，4℃保存备用；② 底物溶液的配制：40mg BAPNA溶于1mL二甲基亚砜中，用37℃的Tris—HCl缓冲液（pH 8.2）稀释至100mL；③30%乙酸溶液：量取30mL乙酸加水至100mL。

（2）胰蛋白酶抑制剂的提取：待豆浆冷却后于6 000r/min冷冻离心25min，取5mL上清液，加45mL 0.01mol/L NaOH，磁力搅拌2h，稀释后用于测定。

（3）酶活测定：① 标准管（Ar）：5mL底物与2mL水混合后于37℃保温10min，之后加2mL胰蛋白酶溶液继续于37℃保温10min，最终用1mL 30%乙酸中止反应；② 标准空白管（Abr）：5mL底物与2mL水及1mL 30%乙酸混匀后，于37℃保温10min，之后加2mL胰蛋白酶溶液，继续于37℃保温10min；③ 样品管（As）：5mL底物与2mL豆浆稀释液混匀，于37℃保温10min，之后加入2mL胰蛋白酶溶液37℃保温10min，用1mL 30%乙酸中止反应；④ 样品空白管（Abs）：5mL底物与2mL豆浆稀释液及1mL 30%乙酸混匀，于37℃保温10min，之后加入2mL胰蛋白酶溶液，继续于37℃保温10min；⑤ 反应后将标准管、标准空白管、样品管、样品空白管中溶液过滤后，在410nm下比色。调整胰蛋白酶浓度使标准管与标准空白管之间的吸光值之差在0.38～0.42。调整豆浆稀释倍数，使样品管和样品空白管吸光值之差在0.19～0.21。

活性的表示：定义每10mL反应体系在波长410nm处所减少的0.01吸光度值为1个胰蛋白酶抑制剂活性单位（TIU）。则胰蛋白酶抑制剂的活性计算如下：

式中：

TIU——胰蛋白酶抑制剂活性单位；

c——豆浆稀释倍数；

Ar——标准管吸光值；

Abr——标准空白管吸光值；

As——样品管吸光值；

Abs——样品空白管吸光值。

1.7 数据处理

试验得到的数据用SPSS 17.0统计软件中的方差分析（ANOVO）程序进行分析。用LSD检验判别数据之间的差异性，显著差异水平P＜0.05。重复试验所得数据以均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 粉碎温度和煮浆时间对豆浆中γ－氨基丁酸的影响

不同粉碎温度对豆浆中γ－氨基丁酸含量的影响见图1。由图1可知，在50℃粉碎时，由于低温煮浆糊底，可能损失了部分GABA；而90℃粉碎时，由于豆浆体系在90℃以上高温维持了较长时间，可能由于美拉德反应造成了GABA损失［11］；因此，在60～80℃对大豆进行粉碎得到了较高含量的GABA胚芽豆浆。很多研究［12－14］表明，豆谷类在浸泡和发芽过程中，GABA含量有所提升，这主要是由于大豆在发芽过程中内源酶被激活，L－谷氨酸在谷氨酸脱羧（GAD）的作用下产生GABA［15］。GABA在酸性条件下对热敏感，中性条件下耐热性较好，pH 7条件下，100℃加热15min仍有较好的稳定性［16］。

图1 粉碎温度对胚芽豆浆中GABA含量的影响Figure 1 Effect of pulverizing time on GABA content of germinated soybean milk

煮浆时间对豆浆中γ－氨基丁酸的影响见图2。由图2可知，煮浆时间2～6min对GABA含量影响不大，煮浆4min时 GABA含量最高，达1.37mg/100mL；4min之后 GABA含量呈下降趋势，加热8min时含量仅为1.26mg/100mL。

图2 煮浆时间对胚芽豆浆中GABA含量的影响Figure 2 Effect of cooking time on GABA content of germinated soybean milk

2.2 粉碎温度和煮浆时间对豆浆中游离氨基酸含量的影响

粉碎温度对豆浆中游离氨基酸的影响见表2。由表2可知，在胚芽豆浆游离氨基酸中，半胱氨酸和苏氨酸为主要氨基酸，分别占氨基酸总量的25.70%和26.55%。在70℃粉碎时总游离氨基酸含量最高，高于80℃后总氨基酸含量明显下降。除色氨酸外，其余7种必需氨基酸在低温粉碎（50，60，70℃）时含量较高，80，90℃之后下降较为明显，这可能是因为过高的粉碎温度会造成氨基酸的破坏，使其更易于与豆浆中的还原糖发生美拉德反应。

煮浆时间对豆浆中游离氨基酸的影响见表3。由表3可知，随煮浆时间延长，氨基酸含量略有增加，煮浆8min，总氨基酸含量最高，达0.505 5mg/mL；煮浆6min时，必需氨基酸含量最高，为0.248 5mg/mL。

2.3 粉碎温度和煮浆时间对豆浆中胰蛋白酶抑制剂含量的影响

胰蛋白酶抑制剂为豆浆中较难去除的抗营养因子，对豆浆的蛋白质利用率有较大影响。豆浆中胰蛋白酶抑制剂残留率降至10%～15%以下时可使豆浆中的蛋白得到最大利用［17］。

粉碎温度对豆浆中胰蛋白酶抑制剂含量的影响见图3。由图3可知，粉碎温度越高，豆浆中胰蛋白抑制剂含量越低。70℃及以上温度粉碎，豆浆中胰蛋白酶抑制剂含量明显减少，这主要由于高温粉碎使豆浆处于高温状态的时间较长，对胰蛋白酶抑制剂的灭活程度较高。高温粉碎类似于对豆种的热烫，使胰蛋白抑制剂在豆种细粉碎前得到了一定灭活［18］，也减少了胰蛋白抑制剂后续煮浆阶段向浆液中的溶解。因此，高粉碎温度有利于减少豆浆中胰蛋白抑制剂的含量。

表2 粉碎温度对胚芽豆浆中游离氨基酸含量的影响Table 2 Effect of pulverizing temperature on free amino acid content of germinated soybean milk

煮浆时间对豆浆中胰蛋白酶抑制剂含量的影响见图4。由图4可知，煮浆时间越长，胰蛋白酶抑制剂含量越低。煮浆2～4min条件下，随煮浆时间延长，胰蛋白酶抑制剂活性降低较明显，煮浆4～8min条件下变化较为平稳，主要由于较易灭活的KSTI部分已灭活，而继续的短时加热对BBI部分影响不大。

在粉碎温度方面，60～80℃时粉碎可得到GABA含量较高的胚芽豆浆，但70～90℃时粉碎对胰蛋白抑制剂有较好的灭活作用，且70℃时胚芽豆浆有较高的氨基酸含量，在风味和豆浆机适用上均有一定优势，因此选择70℃作为最佳粉碎温度。在煮浆时间上，煮浆4min时GABA含量最高，且4min后胰蛋白抑制剂无明显下降，故选择4min为最佳煮浆时间。

2.4 胚芽豆浆与干豆豆浆相关指标的对比

采用上述程序所制得的胚芽豆浆中GABA含量为（1.37±0.20）mg/100mL，为干豆豆浆（0.37mg/100g±0.09 mg/100mL）的3.68倍。大豆在浸泡发芽过程中，种子吸胀，酶活性增加，L－谷氨酸在谷氨酸脱酸酶的作用下生成GABA。尤其在浸泡和发芽初期，GABA急剧增加［19］。此外，豆种在浸泡发芽过程中的质构变化，使其更容易破碎，更有利于各种营养物质向浆液中的溶出。

表3 煮浆时间对胚芽豆浆中游离氨基酸含量的影响Table 3 Effect of cooking time on free amino acid content of germinated soybean milk

图3 粉碎温度对胚芽豆浆中胰蛋白酶抑制剂含量的影响Figure 3 Effect of pulverizing time on TIA content of germinated soybean milk

胚芽豆浆和干豆豆浆中游离氨基酸含量见表4。由表4可知，胚芽豆浆在总游离氨基酸和必需氨基酸方面均有明显提高，分别为干豆豆浆的1.34倍和8.87倍。必需氨基酸中，苏氨酸和蛋氨酸含量明显提高，分别为干豆豆浆的31倍和21倍，缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸也有不同程度的提升。

图4 煮浆时间对胚芽豆浆中胰蛋白酶抑制剂含量的影响Figure 4 Effect of cooking time on TIA content of germinated soybean milk

表4 胚芽豆浆和干豆豆浆中游离氨基酸含量对比Table 4 Free amino acid content of germinated soy milk and unsoaked soy milk

胚芽豆浆胰蛋白酶抑制剂活力为（938.00±28.28）TIU，相比于干豆豆浆的酶活（737.75±95.80）TIU略高。尽管在发芽过程中使胰蛋白酶抑制剂含量有所下降，但其质构在发芽过程中变软，更有利于蛋白质的溶出，因此也更易于胰蛋白酶抑制剂向豆浆中溶出。

3 结论

大豆在浸水发芽过程中，质构发生变化，理化性质、营养成分、抗营养因子均有一定改变。以氨基酸、GABA、胰蛋白酶抑制剂为优化目标，得到的胚芽豆浆最佳制浆工艺为：粉碎温度70℃，煮浆时间4min。与干豆豆浆相比，胚芽豆浆在胰蛋白酶抑制剂含量上略高，这可能是由于发芽导致豆种质构变得松软，易于粉碎，利于胰蛋白酶抑制剂溶出。但是，胚芽豆浆的氨基酸含量和GABA含量远远大于干豆豆浆。此外，胚芽豆浆在异黄酮、植酸、总酚方面也有较大优势［20］。因此，胚芽豆浆仍有较大的开发与应用空间。

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