再生基因蛋白Ⅳ、骨桥蛋白、表皮生长因子受体蛋白在胃腺癌中的表达及临床意义

杨德生康玉华李福春1孙珠蕾2胡军红3陈宏超4索智敏

(河南大学淮河医院消化内科，河南开封475000)

摘要〔〕目的研究再生基因蛋白(Reg)Ⅳ、骨桥蛋白(OPN)及表皮生长因子受体(EGFR)在胃腺癌中的表达及与其临床意义。方法应用S-P免疫组化技术检测65例胃腺癌及其相应的癌旁正常组织中RegⅣ、OPN、EGFR蛋白的表达。结果65例胃腺癌组织中RegⅣ、OPN、EGFR蛋白的阳性表达率53.8%(35/65)， 63.1%(41/65)， 56.9%(37/65)均高于癌旁正常组织12.3%(8/65)、4.6%(3/65)、18.5%(12/65)(P<0.05)。RegⅣ蛋白的表达与胃癌分化程度相关有统计学意义(P<0.05)，OPN蛋白的表达与浸润深度、肿瘤分化程度、临床分期相关有统计学意义(P<0.05)，EGFR蛋白的表达与胃腺癌的浸润深度、淋巴结转移、临床分期相关有统计学意义(P<0.05)。RegⅣ、OPN与EGFR蛋白在胃腺癌组织中的表达呈正相关关系(P<0.05)，RegⅣ与OPN蛋白在胃腺癌组织中的表达呈正相关关系(P<0.05)。结论RegⅣ、OPN、EGFR蛋白均在胃癌组织中表达呈正相关，并在胃癌的发生发展发挥重要作用。

关键词〔〕再生基因蛋白Ⅳ；骨桥蛋白；表皮生长因子受体；胃腺癌；免疫组织化学

中图分类号〔〕R735.2〔文献标识码〕A〔

1河南大学淮河医院超声科2河南大学淮河医院病理科

3河南大学淮河医院普通外科4郑州市第一人民医院消化内科

第一作者：杨德生(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事消化道肿瘤研究。

胃癌是病死率仅次于肺癌，在中国的发病率正在逐年上升的趋势〔1~3〕，其中绝大多数为胃腺癌。尽管已有治疗研究取得重大进展，但仍不能令人满意，胃腺癌的5年生产率仍然很低。胃癌治疗方面研究的突破取决于胃癌的复杂的分子机制等基础研究的进展〔4〕。研究发现多种基因和表观遗传学的改变在胃癌的发生发展中发挥重要作用，比如粒酶活性，遗传不稳定性、原癌基因、抑癌基因、生长因子、基质降解酶、细胞周期调控蛋白、细胞黏附分子等〔5~7〕。再生基因蛋白(Reg)基因家族是钙依赖性凝集素超家族〔1,2〕，在一些胃肠道肿瘤中表达上调，参与细胞增殖和分化，RegⅣ是其中一个新成员〔3,8〕。骨桥蛋白(OPN)是在最初骨基质中发现的，具有多种功能的一种胞外基质蛋白，参与细胞黏附和细胞迁移，影响肿瘤发生和转移进程〔9〕。表皮生长因子受体(EGFR)为酪氨酸激酶受体，在体内通过多种信号途径在肿瘤的发生发展中发挥重要作用〔10〕。在胃腺癌中EZH2与EGFR、Akt的蛋白水平的表达之间的关系国内外未见报道。因此，本研究采用免疫组织化学染色法检测RegⅣ、OPN、EGFR蛋白在胃癌及癌旁正常组织中的表达，为阐明其与胃癌的关系，探讨RegⅣ、OPN、EGFR蛋白在胃癌中的作用及潜在的作用机制。

1材料与方法

1.1标本来自河南大学淮河医院普通外科2010年1月至2011年6月手术切除新鲜胃腺癌标本 65例，均经HE切片病理证实，所有病例术前均未接受任何放疗或化疗，并排除其他脏器的恶性肿瘤。选取同一病例的癌旁切缘正常组织65例作为对照组。65例胃腺癌中，男34例，女31例；年龄27~79〔平均(46.3±4.5)〕岁；高、中、低分化腺癌分别为16例、22例和27例；淋巴结转移44例，无转移21例；按TNM分期标准，Ⅰ期9例，Ⅱ期15例，Ⅲ期19例及Ⅳ期22例；按浸润深度分，T110例，T215例，T317例， T423例。

1.2试剂及方法浓缩型鼠抗人单克隆抗体RegⅣ、OPN、EGFR及免疫组化试剂盒、DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。用免疫组化(S-P 法)法：取厚4 μm石蜡切片，常规脱蜡、水化后，采用电炉加热煮沸修复抗原；RegⅣ、OPN、EGFR蛋白单克隆抗体均按1∶100稀释，操作参照产品说明书，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。用已证实的RegⅣ、OPN、EGFR染色阳性胃腺癌切片作阳性对照。

1.3结果判断RegⅣ、OPN、EGFR蛋白均按照以下标准：根据染色程度及阳性细胞数来计算评分，a 染色程度:0阴性，1弱阳性，2中等阳性，3强阳性；b 阳性细胞数:无阳性细胞0，阳性细胞1%~25% 1分，阳性细胞26%~50% 2分，阳性细胞>50% 3分；a+b之和为3~6分者评为免疫组织染色阳性；计数方法，结果判定在双盲法下进行，每张切片由两名病理医师分别判断。两者不一致时重新计数。

1.4统计学方法应用SPSS13.0软件进行χ2检验、非参数检验的秩和检验，双变量相关关系分析采用Spearman相关分析。

2结果

2.1RegⅣ、OPN、EGFR蛋白的表达 65例胃腺癌组织中，RegⅣ蛋白阳性表达率53.8%(35/65)，其阳性表达部位为细胞核；OPN的阳性表达率63.1%(41/65)，阳性表达部位为主要在细胞质；EGFR的阳性表达率56.9%(37/65)，阳性表达部位为细胞膜，均呈强阳性过度表达现象。癌旁正常组织中，RegⅣ、OPN、EGFR蛋白均为弱阳性低表达，阳性表达率分别为12.3%(8/65)、4.6%(3/65)、18.5%(12/65)。两组间表达差异有统计学意义(χ2=25.333、49.609、20.471，P=0.00)。见图1。

2.2Reg Ⅳ、OPN、EGFR蛋白的表达与胃腺癌的临床病理特征的关系Reg Ⅳ蛋白的表达与胃癌分化程度相关有统计学意义(P<0.05)，与淋巴结转移程度、临床分期及浸润深度无关(P>0.05);OPN与EGFR蛋白的表达与胃腺癌的浸润深度、淋巴结转移、临床分期相关有统计学意义(P<0.05)，与肿瘤分化程度无关(P>0.05)。见表1。

表1　RegⅣ、OPN、EGFR蛋白阳性表达与

2.3RegⅣ、OPN、EGFR蛋白在胃腺癌中表达之间的相互关系RegⅣ、OPN与EGFR蛋白在胃腺癌组织中的表达呈正相关(r=0.254,P=0.041;r=0.300,P=0.015)，RegⅣ与OPN蛋白在胃腺癌组织中的表达呈正相关(r=0.251,P<0.05)。

RegⅣ

OPN

EGFR

3讨论

Reg代表一组小的细胞再生和增殖所必需的分泌蛋白，形成一种免疫系统〔11,12〕。人的Reg家族中，人RegⅣ基因位于1号染色体上，不像其他Reg家族基因均位于2p12〔13〕。RegⅣ可在各种正常组织表达，如胃、大肠、小肠和胰腺〔14,15〕，但其表达水平较癌组织中要低得多〔16〕。Violette等〔17〕的研究表明，Reg Ⅳ在大肠肿瘤(特别是在黏液癌)相对于正常大肠组织。一些研究已经证明，在胃癌组织中高表达RegⅣ蛋白。Bishnupuri等〔18〕报道，用定量聚合酶链反应(PCR)测定，胃癌中RegⅣ基因的表达显著高于正常组织。RegⅣ的抗凋亡特性与大肠癌的进展和胃癌化疗耐药性密切相关〔18,19〕，RegⅣ的表达有望成为一个标记高度恶性潜力的生物学标志物〔15，20，21〕。Oue等〔14〕用免疫组织化学法检测发现，结直肠腺癌RegⅣ蛋白36%高表达，且与肿瘤分期密切相关，而在29%的胃腺癌中高表达，并伴有肠黏蛋白表型和神经内分泌分化，但与肿瘤分期和预后无相关。本研究发现，RegⅣ在胃腺癌中高表达，显著高于癌旁正常组织中的表达，且肿瘤分化程度相关，而与临床分期、淋巴转移、浸润深度无关，与文献报道相符，进一步证实了RegⅣ在胃腺癌中的作用。

EGFR是一种跨膜蛋白，属于ErbB家族受体酪氨酸激酶(RTK)。它被激活后与EGF家族的肽生长因子结合，其中包括表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)-α等〔22,23〕，通过与配体结合诱导ErbB受体聚合物和异二聚体，导致细胞质的激酶结构域的酪氨酸激酶自身磷酸化和激活。激活EGFR结果同时激活多个下游信号转导通路调制的多效性细胞的反应，包括细胞增殖，迁移，侵袭，抑制细胞凋亡〔24〕。本研究发现，EGFR在胃腺癌中高表达，显著高于癌旁正常组织中的表达，且与临床分期、淋巴转移、浸润深度相关，而与肿瘤分化程度无关，与文献报道相符〔25〕，进一步证实了EGFR在胃腺癌中的作用。

OPN首先被确定为一个非胶原骨基质蛋白，它随后被证明是一种细胞因子，调节免疫细胞的移动〔26〕。此外，OPN作为肿瘤侵袭和转移中的一个关键的信号调节通路在乳腺癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌和结肠癌中被证实〔27,28〕的。OPN可绑定到不同的细胞表面受体，包括整合素等，诱导并影响肿瘤细胞的基因表达，增强的移动性和黏附，加速生长和分裂，以及延长细胞的存活，从而肿瘤进展和转移的过程中发挥重要作用〔29,30〕。OPN最近被认为是肿瘤进展〔31〕的一个新的标志物。OPN的高表达水平与肿瘤分期，转移及患者生存期密切相关〔32〕。在本研究中骨桥蛋白表达于细胞质，在胃腺癌中的阳性率显著高于癌旁正常组织，且其表达与肿瘤的淋巴转移、浸润深度、临床分期相关，这与目前文献报道相符〔33,34〕。

RegⅣ激活的信号转导通路知之甚少。EGFR在MKN28和TMK1细胞中形成自分泌和旁分泌环路〔35〕。据报道，高磷酸化水平的表皮生长因子受体和RegⅣ在MKN28和TMK1细胞系中，RegⅣ与EGFR的高磷酸化水平与EGFR的磷酸化有关〔36〕。Kuniyasu等〔37〕研究发现在RegⅣ转染MKN28和TMK1胃癌细胞系中可增加的EGFR磷酸化水平。在RegⅣ转染的MKN28和TMK1细胞系中，RegⅣ可增加EGFR的磷酸化。在敲除RegⅣ的MKN45细胞中，反比抑制表皮生长因子受体磷酸化表达。Bishnupuri等〔36〕通过观察结肠腺癌细胞纯化rhR4对的信号传导通路响应Reg Ⅳ的影响，得出rhR4治疗导致EGFR酪氨酸992和Tyr 1068和Akt蛋白在苏氨酸308和丝氨酸473的快速磷酸化，推测在人结肠癌细胞系RegⅣ蛋白是一种强效的EGFR/磷酸肌醇3-kinase/Akt/AP-1的信号转导通路激活剂。激活EGFR信号传导通路在结肠癌细胞的有丝分裂信号，增加细胞增殖，血管生成，转移和抗细胞凋亡〔38〕。Nanakin等〔39〕发现，在SW403细胞系中EGF和TGF-α可增强RegⅣ基因表达的ERK信号通路。两者合计，这些研究表明，阳性表达EGF和RegⅣ之 间存在反馈回路中的信号通路。因此，阻断RegⅣ/EGFR信号传导可作为人胃肠腺癌的潜在的治疗干预措施。本研究发现，RegⅣ和EGFR在胃腺癌中的表达呈正相关，进一步从蛋白水平证实了上述观点。

EGFR和OPN之间的相互作用，在体外的一些实验性肿瘤系统已被证明，但是，也有没有报告其在对人的活检组织体内实验中报道较少。研究发现，由EGF通过与受体结合可以在乳腺癌细胞，大鼠肾上皮细胞〔40〕，HepG2细胞〔41〕，和HL60细胞〔42〕中诱导骨桥蛋白基因的表达〔43〕。在另一方面，在对乳腺癌细胞的体外研究表明，肿瘤细胞中的下游信号转导途径的激活导致了与整合结合的OPN诱发的c-Src的依赖性的EGFR的转录〔29〕。EGFR酪氨酸激酶信号途径可被内在受体终止。整合素和生长因子受体各种激活和抑制信号的平衡被认为可以确定细胞的命运。然而，整合素和生长因子受体之间的相互作用比简单的独立激活相同的信号通路更复杂〔44〕。在缺乏配体如EGFR的情况，整合素所诱导多种受体酪氨酸激酶激活都将被中断。在细胞的生长和延长细胞的存活，蛋白质水解等生物学效应方面，骨桥蛋白和表皮生长因子受体配体结合和Akt的活化的信号途径是重叠的〔45〕。

癌症的发生发展是多个基因的相互作用的结果。更好地了解发生癌变过程中基因表达的变化，可用于肿瘤的诊断，治疗和预防。新的生物标志物对癌症诊断和治疗的新靶点鉴定的一个主要目标〔46〕。本研究显示，RegⅣ、OPN、EGFR在胃腺癌组织中高表达，且其表达呈正相关，提示三者在胃癌的发生发展中呈潜在的相互协调作用，联合监测3个指标有望对胃腺癌的早期诊断、靶向治疗和预后评估提供参考，Reg Ⅳ、OPN、EGFR在胃腺癌中的具体作用机制还有待进一步实验证明。

4参考文献

1Alberts SR,Cervantes A,Velde CJ.Gastric cancer:epidemiology,pathology and treatment〔J〕.Ann Oncol,2003；14(9002):31-6.

2Yang L.Incidence and mortality of gastric cancer in China〔J〕.World J Gastroenterol,2006；12(1):17-20.

3Lu JB,Sun XB,Dai DX,etal.Epidemiology of gastroenterologic cancer in Henan Province,China〔J〕.World J Gastroenterol,2003；9(11):2400-3.

4Yasui W,Sentani K,Sakamoto N,etal.Molecular pathology of gastric cancer:research and practice〔J〕.Pathol Res Pract,2011；207(10):608-12.

5Yasui W,Oue N,Aung PP,etal.Molecular-pathological prognostic factors of gastric cancer:a review〔J〕.Gastric Cancer,2005；8(2):86-94.

6Yasui W,Oue N,Sentani K,etal.Transcriptome dissection of gastric cancer:identification of novel diagnostic and therapeutic targets from pathology specimens(review article)〔J〕.Pathol Int,2009;59(3):121-36.

7Yasui W,Sentani K,Motoshita J.Molecular pathobiology of gastric cancer〔J〕.H Scand J Surg,2006;95(4):225-31.

8Chakraborty C,Katsumata N,Myal Y,etal.Age-related changes in peptide-23/pancreatitis-associated protein and pancreatic stone protein/reg gene expression in the rat and regulation by growth hormone-releasing hormone 〔J〕.Endocrinology,1995;136(5):1843-9.

9Sodek J,Ganss B,McKee MD.Osteopontin〔J〕.Crit Rev Oral Biol Med,2000;11(3):279-303.

10Heuckmann JM,Rauh D,Thomas RK.Epidermal growth factor receptor(EGFR) signaling and covalent EGFR inhibition in lung cancer〔J〕.Clin Oncol,2012;30(27):3417-20.

11Dusetti NJ,Frigerio JM,Fox MF,etal.Molecular cloning,genomic organization,and chromosomal localization of the human pancreatitis-associated protein(PAP) gene〔J〕.Genomics,1994;19(1):108-14.

12Broekaert D,Eyckerman S,Lavens D,etal.Comparison of leptin-and interleukin-6-regulated expression of the rPAP gene family:evidence for differential co-regulatory signals〔J〕.Eur Cytokine Netw,2002;13(1):78-85.

13Nata K,Liu Y,Xu L,etal.Molecular cloning,expression and chromosomal localization of a novel human REG family gene,REGⅣ〔J〕.Gene,2004;340(1):161-70.

14Oue N,Mitani Y,Aung PP,etal.Expression and localization of Reg Ⅳ in human neoplastic and non-neoplastic tissues:Reg Ⅳ expression is associated with intestinal and neuroendocrine differentiation in gastric adenocarcinoma〔J〕.J Pathol,2005;207(2):185-98.

15Gu Z,Rubin MA,Yang Y,etal.Reg Ⅳ:a promising marker of hormone refractory metastatic prostate cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2005;11(6):2237-43.

16Oue N,Hamai Y,Mitani Y,etal.Gene expression profile of gastric carcinoma:identification of genes and tags potentially involved in invasion,metastasis,and carcinogenesis by serial analysis of gene expression〔J〕.Cancer Res,2004;64(7):2397-405.

17Violette S,Festor E,Pandrea-Vasile I,etal.Reg Ⅳ,a new member of the regenerating gene family,is overexpressed in colorectal carcinomas〔J〕.Int J Cancer,2003;103(2):185-93.

18Bishnupuri KS,Luo Q,Korzenik JR,etal.Dysregulation of Reg gene expression occurs early in gastrointestinal tumorigenesis and regulates anti-apoptotic genes〔J〕.Cancer Biol Ther,2006;5(12):1714-20.

19Mitani Y,Oue N,Matsumura S,etal.RegⅣ is a serum biomarker for gastric cancer patients and predicts response to 5-fluorouracil-based chemotherapy〔J〕.Oncogene,2007;26(30):4383-93.

20Heiskala K,Giles-Komar J,Heiskala M,etal.High expression of RELP(Reg Ⅳ)in neoplastic goblet cells of appendiceal mucinous cystadenoma and pseudomyxoma peritonei〔J〕.Virchows Arch,2006;33(448):295-300.

21Pankova-Kholmyansky I,Arber N.Reg Ⅳ can serve for early diagnosis and therapy〔J〕.Cancer Biol Ther,2007;6(1):123-4.

22Wells A.EGF receptor〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,1999;31:637-43.

23Prenzel N,Fischer OM,Streit S,etal.The epidermal growth factor receptor family as a central element for cellular signal transduction and diversification〔J〕.Endocr Relat Cancer,2001;8(1):11-31.

24Lu Z,Jiang G,Blume-Jensen P,etal.Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase〔J〕.Mol Cell Biol,2001;21(12):4016-31.

25张红雨，陶红梅，陈红涛.表皮生长因子受体和蛋白激酶B在胃癌组织中的表达及临床意义〔J〕.中华胃肠外科杂志,2011;14(2):140-2.

26Guarino V,Faviana P,Salvatore G,etal.Osteopontin is overexpressed in human papillary thyroid carcinomas and enhances thyroid carcinoma cell invasiveness〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2005;90(9):5270-8.

27Cook AC,Tuck AB,McCarthy S,etal.Osteopontin induces multiple changes in gene expression that reflect the six ‘hallmarks of cancer’ in a model of breast cancer progression〔J〕.Mol Carcinog,2005;43(4):225-36.

28Irby RB,McCarthy SM,Yeatman TJ.Osteopontin regulates multiple functions contributing to human colon cancer development and progression〔J〕.Clin Exp Metastasis,2004;21(6):515-23.

29Tuck AB,Hota C,Wilson SM,etal.Osteopontin-induced migration of human mammary epithelial cells involves activation of EGF receptor and multiple signal transduction pathways〔J〕.Oncogene,2003;22(8):1198-205.

30Wai PY,Kuo PC.Osteopontin:regulation in tumor metastasis〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2008;27(1):103-18.

31Weber GF.The metastasis gene osteopontin:a candidate target for cancer therapy〔J〕.Biochem Biophys Acta,2001;1552(2):61-85.

32Eschrich S,Yang I,Bloom G,etal.Molecular staging for survival prediction of gastric cancer patients〔J〕.J Clin Oncol,2005;23:3526-35.

33Kim JY,Bae BN,Kim KS,etal.Osteopontin,CD44,and NFkappaB expression in gastric adenocarcinoma〔J〕.Cancer Res Treat,2009;41(1):29-35.

34张东涛,袁静,杨力,等.骨桥蛋白在胃癌中的表达及与胃癌侵袭转移的关系〔J〕.中华肿瘤杂志,2005;27(3):167-9.

35Takekura N,Yasui W,Kyo E,etal.Effects of tyrosine kinase inhibitor,erbstatin,on cell growth and growth-factor/receptor gene expression in human gastric carcinoma cells〔J〕.Int J Cancer,2001;47(6):938-42.

36Bishnupuri KS,Luo Q,Murmu N,etal.RegⅣ activates the epidermal growth factor receptor/Akt/AP-1 signaling pathway in colon adenocarcinomas〔J〕.Gastroenterology,2006;130(1):137-49.

37Kuniyasu H,Oue N,Sasahira T,etal.Reg Ⅳ enhances peritoneal metastasis in gastric carcinomas〔J〕.Cell Proliferation,2009;42(1):110-21.

38Baselga J.Epidermal growth factor receptor pathway inhibitors.Update〔J〕.Onco Cancer Therapeutics,2006;1(3):299-310.

39Nanakin A,Fukui H,Fujii S,etal.Expression of the REG Ⅳ gene in ulcerative colitis〔J〕.Lab Invest,2007;87(3):304-14.

40Malyankar UM,Almeida M,Johnson RJ,etal.Osteopontin regulation in cultured rat renal epithelial cells〔J〕.Kidney Int,1997;51(6):1766-73.

41Zhang G,Zhao ZQ,Wang HD,etal.Enhancement of osteopontin expression in HepG2 cells by epidermal growth factor via phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway〔J〕.World J Gastroenterol,2004;10(2):205-8.

42Chakalaparampil I,Peri A,Nemir M,etal.Cells in vivo and in vitro from osteopetrotic mice homozygous for c-src disruption show suppression of synthesis of osteopontin,a multifunctional extracellular matrix protein〔J〕.Oncogene,1996;12(7):1457-67.

43Zhang G,He B,Weber GF.Growth factor signaling induces metastasis genes in transformed cells:molecular connection between Akt kinase and osteopontin in breast cancer〔J〕.Mol Cell Biol,2003;23(18):6507-19.

44Ivaska J,Heino J.Interplay between cell adhesion and growth factor receptors:from the plasma membrane to the endosomes〔J〕.Cell Tissue Res,2010;339(1):111-20.

45Matusan-Ilijas K,Damante G,Fabbro D,etal.EGFR expression is linked to osteopontin and NF-κB signaling in clear cell renal cell carcinoma〔J〕.Clin Transl Oncol,2012;10(1):12089-94.

46Yasui W,Oue N,Ito R,etal.Search for new biomarkers of gastric cancer through serial analysis of gene expression and its clinical implications〔J〕.Cancer Sci,2004;95(5):385-92.

〔2013-09-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)