·基础研究·

补阳还五汤对阿尔茨海默病小鼠NF-κBp65蛋白的影响

费洪新1周忠光刘斌

(黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江哈尔滨150040)

摘要〔〕目的研究补阳还五汤(BYHWD)对阿尔茨海默病(AD)小鼠NF-κBp65蛋白表达的影响。方法小鼠随机分成对照组、模型组、治疗组(吡拉西坦0.62 g·kg-1·d-1)、BYHWD高剂量组(37.06 g·kg-1·d-1)、BYHWD中剂量组(18.53 g·kg-1·d-1)、BYHWD低剂量组(9.26 g·kg-1·d-1)，连续治疗28 d后取材。显微镜观察小鼠海马镜下形态结构。免疫组化、实时定量PCR及其Wester印迹检测AD小鼠NF-κBp65蛋白的表达。结果与对照组比较，模型组小鼠神经元数量减少、发生变性，NF-κBp65蛋白水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，BYHWD组海马神经元细胞形态改善明显，NF-κBp65蛋白水平明显降低。结论BYHWD能维持AD小鼠神经元的正常形态结构，降低NF-κBp65蛋白水平。

关键词〔〕补阳还五汤；阿尔茨海默病；NF-κB

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81373777，81173599)

通讯作者：周忠光(1957-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事痴呆、痛风、肿瘤的研究。

1齐齐哈尔医学院基础医学院

第一作者：费洪新(1978-)，男，在读博士，讲师，主要从事痴呆、痛风、肿瘤的研究。

The effects of Buyang Huanwu decoction on the NF-κBp65 protein in Alzheimer's disease mouse

FEI Hong-Xin，ZHOU Zhong-Guang，LIU Bin.

Research Institute of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040， Heilongjiang, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the effect of Buyang Huanwu decoction(BYHWD) on the NF-κBp65 protein in Alzheimer's disease(AD) mouse.MethodsThe mice were randomly divided into control，model，treatment(piracetam 0.62 g·kg-1·d-1)，BYHWD high-dose(37.06 g·kg-1·d-1)，BYHWD middle-dose (18.53 g·kg-1·d-1)，BYHWD low-dose(9.26 g·kg-1·d-1) groups.The mice were killed after 28 days continuous treating. After the treatment, all animals were sacrificed，morphology of hippocampal was observed. Immunohistochemical，real time quantitative PCR，Western blot were used to detect the content of NF-κBp65 protein in the hippocampal.ResultsCompared with those of control group，the mice in model group lost normal morphological structure of nerve cells and the number of nerve cells was significantly decreased，NF-κBp65 protein was significantly increased(P<0.05).Compared with that of model group，the brain maintained normal morphological structure of nerve cells，NF-κBp65 protein was significantly decreased(P<0.05)in BYHWD group.ConclusionsBYHWD could maintain normal morphological structure of nerve cells of AD mice，decrease NF-κBp65 protein responses.

【Key words】Buyang Huanwu decoction；Alzheimer's disease；NF-κB

阿尔茨海默病(AD)是常见的中枢神经系统退行性疾病，表现为脑组织海马功能异常、结构紊乱、β-淀粉样蛋白(Aβ)的沉积〔1〕。Zlokovic〔2〕提出AD的神经血管假说，指出神经血管单元包括神经元、血管内皮细胞、神经胶质细胞、周细胞、基膜，AD的神经元及其脑血管改变引起多种级联反应，包括神经元结构改变、脑海马组织对Aβ清除异常致Aβ沉积等，引起海马形态结构改变、相关蛋白质表达异常。海马组织上存在Aβ转运体蛋白受体系统，Aβ的清除主要通过位于海马组织的晚期糖基化终末产物受体(RAGE)及低密度脂蛋白相关蛋白(LRP)1来完成〔3〕。RAGE是海马Aβ的主要内向转运体，通过内吞和跨膜作用结合Aβ，介导Aβ进入脑组织。Aβ与RAGE相互作用导致，Aβ跨血脑屏障转运进入脑实质，并与相应神经元结合及核因子(NF)-κBp65介导活化，导致炎性细胞因子白介素(IL)-6、内皮素(ET)-1的大量表达，同时NF-κBp65促进了AGE蛋白与RAGE的结合，进而促进炎症反应，促进AD的发生发展〔4〕。补阳还五汤(BYHWD)明显改善脑缺血再灌注的损伤作用〔5〕，改善脑梗死期间血管内皮生长因子的表达〔6〕，上调大鼠脑出血模型血管生成素-1的表达〔7〕，但其对AD的NF-κBp65蛋白的研究，国内外尚无报道。本研究应用BYHWD对AD小鼠进行干预，进一步研究AD与NF-κBp65信号传导通路的关系，探求与AD治疗评价密切相关的靶点因子。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1动物雄性7月龄APP/PS1双转基因小鼠(由哈尔滨医科大学解剖教研室吴树亮教授赠送)；野生型C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物技术公司)，质量合格证号：SCXK(京)2012-0001。小鼠常温、常湿饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心。

1.1.2试剂及药品NF-κBp65(Santa Cruz Biotechnology，sc-109)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology，sc-47778)； PrimeScript®RT reagent KIT(日本TaKaRa公司)；RNeasy@Mini Kit(美国QIAGEN公司)；吡拉西坦(湖南迪诺制药有限公司，130325)； BYHWD包括生黄芪120g(批号131109)、当归尾6g(批号131001)、赤芍4.5 g(批号121003)、川芎3 g(批号20140501)、地龙3 g(批号121002)、桃仁3g(批号20140401)、红花3 g(批号130901)，由黑龙江中医药大学周忠光教授购买于黑龙江中医药大学附属第一医院，并由田明教授制备成水煎剂、干粉，低温保存备用。

1.1.3仪器HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统(武汉千屏影像技术有限公司)；CM1900冰冻切片机(Leica公司)；TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；PLZOZ-S电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)； Applied Biosystems step one plus定量PCR仪(美国应用生物系统公司)等。

1.2方法

1.2.1基因鉴定实验设计APP基因和PS1基因引物，APP引物：上游：5′-GAC TGA CCA CTC GAC CAG GTT CTG-3′，下游：5′-CTT GTA AGT TGG ATT CTC ATA TCC G-3′；PS1引物： 上游：5′-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3′，下游：5-GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT-3′。按照试剂盒说明书操作。

1.2.2分组与给药小鼠随机分成对照组、模型组、治疗组及BYHWD高、中、低剂量组。模型组6只给予生理盐水灌胃，治疗组6只给予吡拉西坦(0.62 g·kg-1·d-1)灌胃，BYHWD高剂量组6只给予(37.06 g·kg-1·d-1)灌胃，BYHWD中剂量组6只给予(18.53 g·kg-1·d-1)灌胃，BYHWD低剂量组6只给予(9.26 g·kg-1·d-1)灌胃，对照组C57BL/6小鼠6只给予生理盐水灌胃，各组灌胃时间28 d。

1.2.3苏木素-伊红(HE)染色小鼠水合氯醛麻醉后，固定小鼠，开胸寻找左心室并灌注100 ml生理盐水，然后再用4%多聚甲醛缓慢匀速灌注固定，断头取脑组织固定于4%多聚甲醛之中，石蜡包埋，制备石蜡切片，切片经过脱蜡、脱水、苏木精染色、分化、伊红染色、脱水、透明、干燥、封片等过程，光学显微镜观察海马组织结构。

1.2.4免疫组织化学染色按照免疫组织化学试剂盒SP法说明书开始测定，石蜡切片需要脱蜡、灭活内源性过氧化物酶、H2O2处理、封闭、滴加一抗、水洗、滴加二抗、水洗、DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封片等。在400倍显微镜下计数棕色细胞的阳性目标数，每组选出6个不同的视野，采用HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统进行分析，计数每组阳性细胞表达数并进行比较分析。NF-κBp65阳性为棕黄色-黄色，表达于细胞核和细胞质内，阴性细胞核为蓝色。

1.2.5实时定量PCR小鼠实验结束后取材海马组织，Trizol试剂盒提取海马总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR扩增。β-actin引物：上游：5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，下游：5′-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3′；NF-κBp65引物：上游：5′-TGT GCG ACA AGG TGC AGA AA-3′，下游：5′-ACA ATG GCC ACT TGC CGA T-3′。 引物由中国上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反应体系参数：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环。扩增产物采用HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统进行分析，实验结果以NF-κBp65/β-actin的比值表示NF-κBp65 mRNA表达量。

1.2.6Western印迹实验结束后，冰台上迅速取小鼠海马，按照说明书进行操作，加入预冷的裂解液，在冰浴下进行匀浆，4℃ 12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，测定蛋白质的浓度，其余上清液迅速放入液氮中，-80℃冰箱中备用。使用前加入5倍上样缓冲液，混匀，置于100℃变性5 min。样品蛋白经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭2 h，分别加入一抗、二抗孵育后，利用HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统分析处理，以目的蛋白的灰度值/β-actin条带灰度值确定NF-κBp65的相对含量。

1.3统计学分析采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1APP/PS1双转基因小鼠基因鉴定APP/PS1双转基因小鼠可检测到APP基因与PS1基因同时表达；野生型C57BL/6小鼠未检测到APP基因与PS1基因同时表达，见图1。

2.2BYHWD对小鼠海马HE染色的影响对照组小鼠海马锥体细胞3～4层，细胞密集，结构清晰；模型组小鼠海马锥体细胞2～3层，细胞稀疏；治疗组小鼠海马锥体细胞3～4层，结构较清晰；高剂量组海马锥体细胞与颗粒细胞2～4层，细胞结构清晰；中剂量组海马锥体细胞3～4层，细胞密集；低剂量组海马锥体细胞2～3层，分布紊乱，见图2。

M：分子量Marker；1、3、5、6条带为APP/PS1双转基因小鼠；2、4、7条带为野生型C57BL/6小鼠 图1　APP与PS1基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图(PCR法)

图2　BYHWD对小鼠海马HE染色的影响(×400)

2.3免疫组织化学检测BYHWD对小鼠海马NF-κBp65表达的影响NF-κBp65位于小鼠脑组织海马神经元细胞核和细胞质内，呈棕黄色或者黄色的颗粒，光镜下观察细胞核和细胞质棕褐色为阳性，见图3。与对照组(10.500 0±1.870 8)比较，模型组小鼠脑组织海马NF-κBp65表达的阳性目标数(19.166 7±2.926 9)明显升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组(11.166 7±2.316 6)、高剂量组(12.500 0±2.881 0)、中剂量组(11.500 0±1.870 8)阳性目标数明显减少(P<0.05)，低剂量组(16.666 7±2.160 3)降低不明显(P>0.05)。

2.4实时定量PCR测定BYHWD对AD小鼠海马NF-κBp65 mRNA表达的影响与对照组(0.83±0.63)比较，模型组小鼠海马NF-κBp65 mRNA表达量(1.27±0.16)明显升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组(0.85±0.24)、高剂量组(1.00±0.11)、中剂量组(0.94±0.19)表达量明显降低(P<0.05)，低剂量组变化不明显(1.21±0.45，P>0.05)。

2.5Western印迹测定BYHWD对AD小鼠海马NF-κBp65蛋白表达的影响与模型组(1.93±0.25)比较，BYHWD组NF-κBp65的表达均有不同程度的降低，低、中、高剂量组分别为1.50±0.19、0.80±0.18、1.23±0.27，以BYHWD中剂量组降低最明显，见图4。对照组与治疗组NF-κBp65蛋白表达量分别为0.93±0.12，1.01±0.28。

图3　BYHWD对小鼠海马NF-κBp65表达的影响(×400)

1:对照组；2:模型组；3:治疗组；4:高剂量组；5:中剂量组；6:低剂量组 图4　BYHWD对AD小鼠海马NF-κBp65蛋白表达的影响

3讨论

AD病理主要表现为Aβ的大量沉积，正常情况Aβ水平保持动态的平衡，一定浓度Aβ对于机体有重要的生理功能〔8〕。而RAGE和NF-κBp65内向转运Aβ增加会引起Aβ水平的清除功能减弱，造成Aβ积聚，形成老年斑〔9〕。基于这些，本课题重点研究NF-κBp65表达。

脑组织海马包括CA1区、CA2区、CA3区、DG区等，CA3区与学习记忆关系密切〔10〕。基于此，本实验形态学重点研究了海马组织CA3区的结构。AD的研究模型包括快速老化小鼠模型、D-半乳糖注射模型、Aβ注射模型、转基因动物模型等〔11〕。基于此，本实验采用APP/PS1双转基因小鼠为研究对象，以BYHWD为处理因素，主要研究BYHWD对APP/PS1双转基因小鼠海马组织NF-κBp65表达的影响。本实验提示，BYHWD高、中剂量对AD小鼠形态结构改善明显。

本研究说明模型组NF-κBp65对Aβ的清除能力减弱，导致Aβ的积聚，引发AD；BYHWD可以通过增加NF-κBp65的表达量来实现其对AD的治疗，以此改善脑组织海马的组织结构，说明低剂量的BYHWD对AD模型小鼠的作用较差。以上提示BYHWD下调了海马组织NF-κBp65的表达，增加了Aβ的转运清除功能，减少脑组织海马的Aβ含量，以此来治疗AD。另外，模型组与Aβ转运密切相关的蛋白质NF-κBp65表达量增加，引起Aβ积聚，引发AD。

综上所述，BYHWD下调脑组织海马NF-κBp65蛋白的表达，这是BYHWD治疗AD的作用机制之一，提示BYHWD治疗AD的靶点蛋白之一是NF-κBp65蛋白，这为BYHWD通过NF-κBp65传导通路治疗AD提供了实验依据。

4参考文献

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10Folstein M，Folstein S.Functional expressions of the aging brain〔J〕.Nutr Rev，2010；68(Z2)： S70.

11费洪新，韩玉生，杜徽，等.补阳还五汤对阿尔茨海默病小鼠形态学及Aβ水平的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2014；20(23)：111-4.

〔2014-12-20修回〕

(编辑李相军)