邹 悦肖 谦苏海涛

结核分枝杆菌利福平耐药与rpoB基因突变特征的关系探讨

邹 悦1肖 谦2苏海涛3

目的分析青岛地区结核分枝杆菌利福平耐药与rpoB基因突变特征的关系。方法青岛地区14株利福平敏感的结核分枝杆菌以及54株利福平耐药的结核分枝杆菌的rpoB基因段应用PCR-DNA测序法给予分析。结果54株利福平耐药菌株中，其中44株出现了rpoB基因81bp核心区突变，而其中14株利福平敏感菌株中未出现rpoB基因81bp核心区突变，比较差异具有统计学意义（P＜0．05）；其中38株利福平低浓度耐药菌株中出现了30株rpoB基因81bp核心区突变，其中16株利福平高浓度耐药菌株中出现了14株rpoB基因81bp核心区突变，比较差异具有统计学意义（P＜0．05）；其中18株非耐多药菌株中出现了14株rpoB基因81bp核心区突变，其中36耐多药菌株中出现了30株rpoB基因81bp核心区突变，比较差异具有统计学意义（P＜0．05）。结论rpoB基因81bp核心区突变是青岛地区结核分枝杆菌对利福平耐药的主要机制。

分枝杆菌；结核；利福平；突变；青岛

结核病是全球以及目前我国严重的一种公共卫生问题［1］。我国是被WHO列为“耐药结核病需引起警示”的国家之一，研究报道发现我国利福平（RFP）耐药率为7.5%，并且耐多药率（MDB-TB）为6.8%［2］。本研究旨在分析青岛地区利福平耐药结核分枝杆菌的rpoB基因突变特征。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 来源于2009年1月～2012年12月青岛市胸科医院确诊68株结核分枝杆菌临床分离株的肺结核患者痰标本，其中包括54株耐药菌株，14株利福平敏感菌株。利福平耐药菌株中包括16株高浓度耐药菌株，38株低浓度耐药菌株；36株耐多药菌株，18株非耐多药菌株。

1.1.2 主要仪器设备 采用加拿大BBI公司生产的PCR反应扩增仪，采用美国ABI公司生产的370测序列分析仪，采用湘仪离心机仪器有限公司生产的YXJ-2离心机，采用上海精益有机玻璃制品仪器厂生产的H6-1微型电泳槽，采用Gene Genius公司生产的凝胶成像系统。

1.1.3 主要试剂 6×DNA Loading Dye、dNTP、TaqDNA聚合酶、MgCl2、10×PCR Buffer（生工）；10×TAE；生工SK1141PCR产物纯化回收试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 细菌DNA的抽提 取100 μL菌悬液加自制的裂解液[（50 mmol/L NaOH、10 mmol/L Tris.HCl（pH 8.0）、1% Triton X-100、1% NP-40、0.5 mmol/L EDTA（pH8.0））200 μL，混匀，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液作模板。置-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 根据结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的 rpoB基 因（Gene ID： 888164） 序 列 设 计 引物：上 游5′- AGGACGTGGAGGCGATCA-3′， 下 游5′-AACGGGTTGACCCGCGCGTA -3′，扩增rpoB基因基因片段长度为307 bp片段， 该片段包括了易发生突变的81bp核心区。

1.2.3 PCR反应体系及反应条件 采用50 μL体系，包括模板1 μL、上下游引物各1μL、dNTP 10 mmol/L 1 μL、Taq Buffer 5 μL、25 mmol/L MgCl25 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL、水36.3 μL；反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55～60 ℃退火35 s，72 ℃延伸40～50 s，72 ℃修复延伸5～8 min，35个循环。

1.2.4 测序 用PCR产物纯化回收试剂盒（生工SK1141）回收DNA扩增片段，送上海生工生物工程股份有限公司测序，在GeneBank中查到rpoB基因（Gene ID：888164）的序列进行比对。

1.3 统计学分析

采用PEMS 3.1软件分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

见图1。本研究所有结核分枝杆菌临床分离株基因扩增后长度为307bp的片段，并且显示扩增阳性率为100%。

图1 1%琼脂糖电泳，150 V、100 mA 20 min电泳观察

2.1 DNA测序结果

14株利福平敏感菌株中均未发生rpoB基因81bp核心区突变，而54株利福平耐药菌株中有44株发生了rpoB基因81bp核心区突变，基因突变率为81.48%（44/54）；44株中30株（占68.18%）为531位点TCG→TTG突变，10株（占22.72%）为526位点CAC→TAC突变，2株（占4.55%）为81bp核心区511位CTG→CCG突变，2株（占4.55%）为511位点CTG→CCG和526位点CAC→AAC双位点突变。38株利福平低浓度耐药菌株中有30株发生了rpoB基因81bp核心区突变，突变率为78.95%（30/38），其中22株为81bp核心区531位点TCG→TTG变异，4株为526位点CAC→TAC突变，2株（占4.55%）为511位点CTG→CCG突变，2株（占4.55%）为511位点CTG→CCG和526位点CAC→AAC双点突变；16株利福平高浓度耐药菌株中有14株发生了rpoB基因81bp核心区突变，突变率为87.50%（14/16），其中8株为531位点TCG→TTG突变，6株为526位点CAC→TAC突变。18株非耐多药菌株中有14株发生了rpoB基因81bp核心区突变，突变率为77.78%（14/18），其中10株（占68.18%）为531位TCG→TTG突变，2株（占22.72%）为526位点CAC→TAC突变，2株（占4.55%）为511位点CTG→CCG突变；而36株耐多药菌株中有30株发生了rpoB基因81bp核心区突变，突变率为83.33%（22/24），其中20株（占68.18%）为531位点TCG→TTG突变，8株（占22.72%）为526位点CAC→TAC突变，2株（占4.55%）为511位点CTG→CCG和526位点CAC→AAC双点突变。见图2～图5。

图2 511位点CTG→CCG突变（对侧链）

图3 526位点CAC→TAC突变（对侧链）

图4 531位点TCG→TTG突变（对侧链）

2.2 rpoB基因81bp核心区突变特征与利福平耐药表型的关系

见表1。54株利福平耐药菌株中，其中44株出现了rpoB基因81bp核心区突变，而其中14株利福平敏感菌株中未出现rpoB基因81bp核心区突变，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 利福平耐药表型与rpoB变异关系

2.3 利福平耐药浓度与rpoB基因81bp核心区突变的关系

见表2。其中38株利福平低浓度耐药菌株中出现了30株rpoB基因81bp核心区突变，其中16株利福平高浓度耐药菌株中出现了14株rpoB基因81bp核心区突变，比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 利福平耐药浓度与rpoB81bp核心区突变关系

2.4 利福平耐药菌株是否耐多药与rpoB基因81bp核心区突变关系

见表3。其中18株非耐多药菌株中出现了14株rpoB基因81bp核心区突变，其中36耐多药菌株中出现了30株rpoB基因81bp核心区突变，比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 利福平耐药菌株是否耐多药与rpoB基因81bp核心区突变关系

3 讨论

利福平是一种快速杀菌剂，该药物作用机制主要是经与结核分枝杆菌RNA聚合酶的β亚单位结合，其中编码β亚单位的基因被命名为rpoB基因［3］。本研究表明，81.48%（44/54）的利福平耐药菌株存在rpoB基因81bp核心区突变，而14株对利福平敏感的结核分枝杆菌临床分离菌株中未发现rpoB基因81bp核心区突变，这说明rpoB基因81bp核心区突变是青岛地区结核分枝杆菌对利福平耐药的主要机制，提示该突变作为青岛地区利福平耐药结核分枝杆菌诊断的分子标记靶点具有较好的临床应用价值，这将在早期诊断、早期选择敏感药物治疗耐药结核病提供较大帮助。

rpoB基因81bp核心区突变率对利福平高浓度耐药菌株与利福平低浓度耐药菌株以及是否耐多药，差异无统计学意义，一定程度上表明rpoB基因81bp核心区突变与耐药浓度及耐药程度不相关。还有18.52%利福平耐药结核分枝杆菌未发现rpoB的变异，说明青岛地区还存在利福平耐药的其他机制，有待进一步研究。此次研究样本量较小，难以全面反映整个青岛地区的利福平耐药结核分枝杆菌rpoB的变异特征，这些需要以后加大样本量，进行深入的研究，以期获得更加全面的科学依据。

［1］肖东楼，赵明刚，王宇等．中国结核病防治规划实施工作指南［M］．北京：中国协和医科大学出版社，2009：1．

［2］全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室．2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告［J］．中国防痨杂志，2012，34（8）：485-508．

［3］朱敏，范玉美，盛国平，等．浙江省耐药结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变特点［J］．研究医学研究杂志，2008，37（3）：26-29．

The Relationship between the Mycobacterium Tuberculosis Rod Rifampicin Resistant and the Characteristics of the RpoB Gene Mutation

ZOU Yue1XIAO Qian2SU Haitao31 Thoracic 2，Chest Hospital in Qingdao City，Qingdao 266043，China，Medical insurance department of Qingdao Ninth People's Hospital，Qingdao 266000，China，3 Thoracic and three branch，Chest Hospital in Qingdao City，Qingdao 266043，China

ObjectiveTo investigate the relationship between mycobacterium tuberculosis rod rifampicin resistant and the characteristics of the rpoB gene mutation．Methods14 cases of the mycobacterium tuberculosis which sensitive to the rifampicin and 54 cases of rpoB gene of mycobacterium tuberculosis with rod rifampicin resistant， which were analysed with PCR-DNA sequencing．ResultsIn 54 strains of rifampicin ， 44 strains of them have rpoB 81bp core mutations， while 14 strains which sensitive to the rifampicin have no rpoB 81 bp core mutations， with significant difference（P＜0．05）; 30 strains have rpoB 81bp core mutations in all 38 strains with rifampicin low concentration drug resistance; 14 strains have rpoB 81bp core mutations in all 16 strains of rifampicin high concentration drug resistance， with statistical difference（P＜ 0．05）; 14 strains have rpoB 81bp core mutations in all 18 strains of non-resistant; 30 strains have rpoB 81bp core mutations in all 36 strains of multidrug resistance， with statistical difference（P＜0．05）．ConclusionRpoB 81bp core mutation is the primary mechanisms of mycobacterium tuberculosis in Qingdao to the rifampin-resistance．

Mycobacterium，Tuberculosis，Rifampicin，Mutation，Qingdao

R3

B

1674-9316（2015）29-0199-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2015．29．146

1 266043青岛市胸科医院胸二科

2 266000青岛市第九人民医院医保科

3 266043青岛市胸科医院胸三科