张小灵，葛俊伟，李玉龙

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；2.哈尔滨维科生物技术开发公司，哈尔滨 150069）

奶牛bTAP蛋白表达载体的构建及其在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

张小灵1，2，葛俊伟1，李玉龙2

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；2.哈尔滨维科生物技术开发公司，哈尔滨 150069）

奶牛气管抗菌肽是一种具有较强抗菌活性的抗菌小肽。实验从奶牛气管组织中提取总RNA，反转录成cDNA，以此为模板，用奶牛气管抗菌肽特异性PCR引物扩增奶牛气管抗菌肽基因，然后将其连入载体pCMV-C-eGFP中构建奶牛气管抗菌肽的真核表达载体bTAP-GFP，并将此载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中，分别运用荧光蛋白观察和细菌记数等方法检测bTAP-GFP蛋白在细胞中的表达及其对大肠杆菌的抗菌活性。试验结果表明，试验成功的建立了奶牛气管抗菌肽的真核表达载体bTAP-GFP，并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗大肠杆菌活性的bTAP-GFP蛋白。

奶牛气管抗菌肽；真核表达载体；奶牛乳腺上皮细胞；基因表达

牛气管抗菌肽(bTAP)是一种从牛气管黏液的酸性抽提物中分离到的阳离子型抗微生物多肽。bTAP有很广泛的抗菌谱，它对对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、真菌等具有明显杀伤作用，而对哺乳动物没有不良影响。虽然bTAP有很好的抗菌活性，然而人们对它的开发与利用却很少。Yarus等最先在小鼠乳腺中表达bTAP，为bTAP作用机制研究和基因工程产品的开发奠定了基础。近些年，bTAP在原核表达系统、毕赤酵母表达系统等的表达也偶见报道。

本试验构建了bTAP的真核表达载体bTAP-GFP，并将此载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中，成功的表达了具有抗大肠杆菌活性的bTAP-GFP蛋白。本试验为bTAP的基因工程产品的开发及其在畜牧业中的应用提供了试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

奶牛乳腺上皮细胞、大肠杆菌（Escherichia coli）菌株由东北农业大学生命中心高学军教授赠送，DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）、Trizol试剂、脂质体2000购于GIBCO公司，构建表达载体的相关试剂购于宝生物试剂公司，真核表达载体pCMV-C-eGFP购于碧云天，PCR引物合成及产物测序在英俊公司。

1.2 试验方法

1.2.1 bTAP真核表达载体的构建Trizol法提取奶牛气管组织中总RNA,M-MLV反转录酶反转录成cDNA，以此cDNA为模板，用bTAP特异性引物（上游引物：5-CGGAATTCATGAGGCTCCATCACCTGCT-3，下划线标记的为EcoR I酶切位点；下游引物：5-GCGTCGAC CTTCTTTCTACAGCATTTTACT-3，下划线标记的为Sal I酶切位点）进行PCR扩增，PCR产物连T载体，转化TOP10感受态细胞，挑阳性克隆测序。测序正确的序列双酶切，连表达载体pCMV-C-eGFP，双酶切鉴定，阳性克隆即为构建的bTAP真核表达载体，标记为bTAP-GFP。将阳性克隆菌种摇菌，提质粒，-20℃保存备用。

1.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的转染奶牛乳腺上皮细胞的转染方法见文献。试验分为空白对照组（B）、转空载体组（GFP）和转bTAP-GFP组（bTAP-GFP）。

1.2.3 bTAP的表达及其抗菌活性的检测bTAP表达的检测：细胞转染培养48h后收集培养液，10倍浓缩，荧光显微镜检测绿色荧光蛋白bTAP-GFP的表达。

bTAP抗菌活性的检测：大肠杆菌（Escherichia coli）用液态LB培养基37℃摇床培养至细菌数约为105CFU/mL培养液。取100μL细胞培养液（收集过程同前文所述）加入1mL大肠杆菌菌液中，37℃摇床孵育1h，然后计算各组菌液中的细菌数。试验分组同上。

2 结果

2.1 bTAP真核表达载体的构建

如图1所示，用bTAP特异性引物进行PCR后，可见明显的目的条带(～200bp)（图1A）；将PCR扩增得到的bTAP基因克隆进pCMV-C-eGFP载体，构建的bTAP-GFP表达载体用EcoR I和Sal I双酶切后出现两条带，一条为表达载体（5010bp），一条为bTAP基因（～200bp）（图1B），且阳性克隆经英俊公司测序，结果与NCBI中bTAP mRNA（NM_174776. 1）序列完全一致。结果表明，本试验成功的构建了bTAP的真核表达载体bTAP-GFP。

图1：bTAP真核表达载体的构建

2.2bTAP-GFP表达的检测

细胞转染bTAP-GFP 48h后，荧光显微镜检测培养液中绿色荧光的表达。结果如图2，转染bTAP-GFP的细胞的培养液中可见绿色荧光，而没转染的空白细胞的培养液中无绿色荧光。结果表明，表达载体bTAP-GFP转染进奶牛乳腺上皮细胞中，并成功的表达了。

图2：bTAP-GFP表达的检测

2.3 bTAP抗菌活性的检测

将1mL大肠杆菌菌液与100μL细胞培养液混合，37℃摇床孵育1h后，计算各组菌液中的细菌数，检测bTAP的抗菌效果。结果如图3所示，在B组和GFP组中，菌液中细菌数明显大于105CFU/mL，而在bTAP-GFP组中，菌液中细菌数明显小于105CFU/mL，且显著低于B组和GFP组。此结果表明，重组表达的bTAP-GFP蛋白对大肠杆菌有显著抑制效果。

图3：bTAP抗菌活性的检测

3 讨论

bTAP有广泛的抗菌活性，尤其对引起细菌性奶牛乳房炎的主要致病菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很好的抗菌活性。bTAP基因是一个利用基因技术治疗奶牛乳房炎的的候选目标基因。但因bTAP的分子量太小，故一般情况下不易检测与纯化，所以目前对bTAP在治疗奶牛乳房炎方面的研究还很少。本试验将扩增出的bTAP序列克隆进pCMV-C-eGFP中，使之能表达bTAP-GFP融合蛋白。GFP为绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下具有示踪的效果，使得融合的bTAP-GFP蛋白能在荧光显微镜下直接观察到，且GFP蛋白本身分子量为27kDa，与bTAP融合表达后也避免了bTAP蛋白分子量过小不利于纯化的问题，所以本试验所表达的bTAP-GFP蛋白既有很好的直观可视性有利于分离纯化。

在自然条件下，bTAP在奶牛中的表达以呼吸系统，尤其是气管中表达量高。但也有研究表明，在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等菌的诱导下，牛乳腺上皮细胞中TAP的表达水平明显提高，即牛TAP基因在多个器官和组织中均可表达，且其表达量与病原微生物的诱导有一定的关系。本试验将构建好的bTAP表达载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中，并成功的表达了对大肠杆菌具有显著的抗菌活性的重组bTAP-GFP蛋白，其结果与上述文献报道一致。

[1]Diamond G,et al.Tracheal antimicrobial peptide,a cysteine-rich peptide from mammalian tracheal mucosa:Peptide isolation and cloning of a cDNA[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991,88:3952 -3956

[2]Schonwetter BS,et al.Epithelial antibiotics induced at sites of inflammation[J].Science.1995，17;267（5204）:1645-8.

[3]王永娟，等.牛气管抗菌cDNA的克隆与表达[J].中国新药杂志, 2006，15（9）:1651-1655.

[4]JoEL E，et a1.Expression of tracheal antirnicrobial peptide in bovine mammary epithelial cells[J].Res Vet Sci,2009,87(1): 59-63．

[5]YOUNG H K,et a1.Cystic fibmsis,lung infections，and a human tracheal antimicmbial peptide(hTAP)[J].FEBS Lett. 1997,405(2):200-208.

[6]高小艳,等.牛气管抗菌肽的原核表达、体外抗茵活性及其组织分布分析[J].畜牧兽医学报,2010,41(9):1166-1171.

[7]王安平，等.牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达与鉴定[J].江苏农业学报，201l，27（6）:1316-1320.

[8]Chao-chao Luo,et al.Goat mammary gland expression of cecropin B to inhibit bacterial pathogens causing mastitis[J].Animal Biotechnology，2013，24:66-78.

[9]Yarus S，et al.Production of active bovine tracheal antimicrobial peptide in milk of trans genicmice[J].Microbiology，1996，93（12）: 14118-14121.

[10]朱善元，等.牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达及条件优化[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2011，32（3）：19-23.

[11]王铁东，等.牛气管抗菌肽在山羊乳腺组织中的表达[J].中国农学通报2009，25（08）：7-11.

[12]DIAMOND G，et a1.Transcriptional regulation of 13-defensin gene expression in tracheal epithelial cells[J].Infect Immun, 2000 68:113-119.

[13]CAVERLY J M,et a1.Coordinated expression of tracheal antimicrobial peptide and inflammatory-response dements in the lungs of neonatal calves with acute bacterial pneumonia[J]. Infect Immun,2003,71:2950-2955.

[14]HIGGS R,et a1.The synthetic from of a novel chicken pdefensin identified in silico is predominantly active against intestinal pathogens[J].Iramunogenetics,2005,57:90-98.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．05.024