SEA联合热疗对Hep-2细胞体外生物学行为的影响及相关机制

鞠洋许承弼江昌刘学识博杰辛丁

(吉林大学第二医院，吉林长春130041)

摘要〔〕目的探讨体外葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合热疗对人喉癌细胞株(Hep-2株)生长、增殖、凋亡等生物学行为的影响。方法应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同条件下对Hep-2细胞的增殖抑制率，流式细胞仪检测Hep-2细胞周期进程的变化及凋亡率，透射电子显微镜检测亚细胞结构改变。结果单纯热疗组、单纯SEA组及联合组(SEA+热疗)对Hep-2细胞增殖抑制率分别 16.5%、25%和45.4%，与对照组相比差别有显著意义；流式细胞仪结果显示G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，且细胞凋亡率升高，组间比较差异显著(P<0.05)。结论SEA联合热疗能显著提高Hep-2细胞的增殖抑制率，抑制G1期细胞向S期细胞转化进程，诱导Hep-2细胞凋亡及亚细胞结构改变。

关键词〔〕人喉头癌细胞株；葡萄糖菌肠毒素A；热疗；细胞周期；凋亡

中图分类号〔〕R739.4〔

通讯作者：辛丁(1963-)，男，教授，主要从事耳鼻咽喉头颈肿瘤研究。

第一作者：鞠洋(1989-)，女，在读硕士，主要从事耳鼻咽喉头颈肿瘤研究。

手术及全身化疗是目前喉癌治疗的主要手段，但是多药耐药的产生严重影响化疗效果及预后，是临床亟待解决的问题〔1〕。因此，尝试新的治疗方法，防止多药耐药的产生，对提高喉癌的治疗效果及生存率有重要意义。本研究应用超抗原葡萄糖菌肠毒素A(SEA)联合热疗观察其对喉头癌细胞株Hep-2生物学行为的影响，旨在为喉癌的生物治疗提供理论依据。

1材料和方法

1.1材料Hep-2细胞株由吉林省肿瘤研究所惠赠，(MTT)试剂及RPMI 1640培养基购于美国Sigma公司，SEA由军事医学科学院微生物流行病研究所提供；胎牛血清购于长春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法取对数生长期的Hep-2细胞，调细胞数为2×105/ml,接种于96孔塑料培养板内，100 μl/孔，当细胞增殖达到80%汇合时进行分组，单纯热疗组43℃±0.2℃持续加热40 min，然后移入37℃ 5%二氧化碳培养箱内静止培养；单纯SEA组，根据预实验结果SEA最适量为40 ng/ml，联合组在单纯SEA组基础上再加热43℃±0.2℃ 40 min，然后移入5%二氧化碳培养箱内静止培养2 h，于结束前6 h加入MTT试剂20 μl/孔，终浓度为500 mg/L继续培养6 h后，吸弃上清加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡10 min,使MTT还原产物完全溶解，酶标仪于570 nm处测定各孔吸光度A值，按下列公式计算Hep-2细胞增殖抑制率。Hep-2细胞抑制率=(1-实验孔细胞A值÷对照孔细胞A值)×100%

1.2.2流式细胞术细胞培养及分组同1.2.1，不同之处是将96孔塑料培养板改为25 ml培养瓶进行，培养结束后经0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，70%冷乙醇固定，上机前过40目网，调细胞数1×106/ml，碘化吖啶(PI)染色，流式细胞仪检测，细胞周期结果以Modiff 2.0软件分析。

1.2.3透射电子显微镜技术细胞培养及分组同1.2.2，收集不同条件下作用的Hep-2细胞，移入锥型离心管内，离心弃上清，应用2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双重染色，透射电子显微镜观察并拍照。

1.3统计学方法应用SPSS11.0软件行t检验或χ2检验。

2结果

2.1MTT结果不同条件下对Hep-2细胞增殖均有抑制作用，与对照组相比差异显著(P<0.05)，但联合组效果明显，两者合用有协同作用。见表1。

组别A值抑制率(%)P值对照组1.52±0.12--热疗组1.27±0.1316.5<0.01SEA组1.14±0.1925.0<0.01联合组0.83±0.1745.4<0.01

2.2流式细胞术不同条件对Hep-2细胞周期各时相的影响G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期相对增多，细胞凋亡率升高，组间比较差异显著(P<0.05)。见表2。

组别G0/G1SG2/M凋亡率对照组29.4±2.664.2±3.56.4±1.22.0热疗组42.7±3.41)38.7±4.11)18.6±2.41)9.21)SEA组48.4±5.11)32.2±3.31)19.4±1.71)13.41)联合组58.5±3.41)19.6±4.41)21.9±2.41)19.51)

与对照组比较：1)P<0.05

2.3透射电子显微镜结果单纯热疗组Hep-2细胞超微结细胞膜破裂，有空泡形成，细胞高度空化，联合组细胞核染色质趋边凝集，可见凋亡小体。见图1。

热疗组

SEA组

联合组

图1电子显微镜下Hep-2细胞结构改变(×5 000)3讨论

肿瘤热疗被称为是继手术、放疗、化疗和生物治疗后的第5种肿瘤治疗方法〔2〕。热疗不仅对肿瘤细胞有直接的细胞毒效应，而且还可以增强放疗化疗的疗效，提高机体的免疫力，因而被国际抗癌组织称之为“肿瘤绿色疗法”。MTT实验可准确反映活细胞数量及细胞活化状态。因此被广泛用于抗肿瘤药物筛选和细胞毒性实验研究，具有一定的客观性。

文献报道〔3〕，热疗可改变细胞周期的两个调控点，一个位于G1-S转折点，控制细胞生长前期(DNA合成期)，另一个调控点位于G2/M期转折点，是决定细胞一分为二的控制点。结果显示，热疗可抑制G1期细胞向S期的转化进程，从而使G1期细胞增多，S期细胞减少，造成G2/M期细胞相对增多，G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反映〔4〕，这一点从细胞凋亡率上得到证实。SEA是一组对热稳定的可溶性蛋白质，能抵抗胃肠液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常见病因〔5〕。SEA杀伤肿瘤有两种途径：一是直接细胞毒效应，二是间接杀伤肿瘤细胞，不需加工直接与(MHC)Ⅱ类分子形成配体，通过配体抑制细胞的增殖，由于SEA对热稳定，所以联合热疗应用优于化学药物。

综上所述，SEA具有直接的细胞毒效应，尤其是喉癌属于腔内浅表肿瘤，应用SEA可直接腔内灌注或瘤体内注射，避免全身使用毒副作用的产生。因此，SEA联合热疗用于喉癌的治疗有广阔前景。

4参考文献

1Chen SJ，Luan J，Zhang HS，etal.EGFR-mediated G1/S transition contributes to the multidrug resistance in breast cancer cells〔J〕.Mol Biol Rep,2012;39(5):5465-71.

2高惠，杨耀琴.热疗与生物治疗的联合抗肿瘤效应〔J〕.国际肿瘤学杂志,2009;36(3)：193-5.

3Lim CU,Zhang Y,Fox MH,etal.Cell cycle dependent apoptosis and cell cycle blocks induced by hyperthermia in Hl-60 cells〔J〕.Int J Hyperthermia,2006;22(1): 77-91.

4Petrovic V,Costa RH,Lau LF,etal.FoxM1 regulates growth factor-induced expression of kinase-interacting stathmin (KIS) to promote cell cycle progression〔J〕.J Biol Chem,2008;283(1):453-60.

5李进，孙颖，李峰.因子Ⅶ-金黄色葡萄球菌肠毒素A融合蛋白的抗肿瘤效果〔J〕.中华肿瘤杂志,2005;27(8)：471-4.

〔2013-10-07修回〕

(编辑袁左鸣)