丹红注射液对阿霉素大鼠心肌损伤的保护作用

彭小平陈璿瑛1李文娟2王梦洪郑泽琪

(南昌大学第一附属医院心内科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的探讨丹红注射液(DH)对阿霉素(ADR)所致大鼠心肌损伤的影响及作用机制。方法腹腔注射ADR建立大鼠心肌损伤模型，随机分为对照组、DH组、ADR组、DH+ADR组，各10只。观察大鼠生理状况，比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量，流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位。结果与ADR组相比，DH预处理能显著改善ADR所致的体重下降，降低LDH、CK的活性和MDA的含量，增强SOD、CAT和GSH-Px的活性。线粒体膜电位数据显示，与ADR组相比，DH显著增加心肌细胞线粒体膜电位。结论DH对ADR所致大鼠心肌损伤具有显著的保护作用，其保护作用与降低心肌氧化应激，提高抗氧化防御和稳定线粒体膜电位有关。

关键词〔〕丹红注射液；心肌损伤；氧化应激；阿霉素

中图分类号〔〕R544.1〔

基金项目：江西省卫生厅课题(No.20081026);南昌大学校基金(2009)

1南昌大学第一附属医院药剂科

2南昌大学食品科学与技术国家重点实验室

第一作者：彭小平(1975-)，男，副教授，在职博士，副主任医师，主要从事冠心病治疗研究。

临床发现长期使用阿霉素(ADR)可产生严重的心脏毒性。因此，研究ADR所致心肌损伤的作用机制及寻找有效的防治措施，已成为当今医学界迫在眉睫的问题〔1，2〕。 研究表明ADR所致心脏毒性机制颇为复杂，目前较为深入并被广泛认可的作用机制是ADR过量产生自由基导致心肌损伤。ADR进入心肌细胞后，在微粒体中经过还原型辅酶Ⅱ(NADPH)及细胞色素P450还原酶催化并提供一个电子变为带一个剩余电子的半醌自由基，经过一系列的电子传递，进而形成氧化应激，最后导致了组织的损伤〔3，4〕。研究证实丹红注射液(DH)具有抑制氧化应激和提高机体抗氧化防御能力，且对缺血性心肌损伤有保护作用，但对抗肿瘤ADR引起心肌损伤的影响尚不清楚〔5，6〕。本研究探讨DH对阿霉素所致大鼠心肌损伤的保护作用及机制。

1材料与方法

1.1实验动物和试剂健康SD大鼠40只，体重(200±20) g，由南昌大学医学院实验动物部提供〔许可证号：SCXK(赣)2006-2001〕。DH 购自菏泽步长制药有限公司。ADR由深圳万乐药业有限公司生产。过氧化氢酶(CAT)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒。细胞乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、肌酸激酶(CK)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；罗丹明123(Rho 123)购自美国Molecular Probes公司。本研究中其余化学试剂均为分析纯产品。

1.2仪器设备流式细胞分析系统(Beckman Coulter公司，美国)；移液器(Eppendorf公司 德国)；紫外分光光度计(中国北京普析通用仪器有限责任公司)；离心机(中国上海安亭科学仪器厂)；超纯水净化系统(Millipore公司，美国)；电子天平(中国上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.3实验方法采用随机平行同期对照的方法，建立大鼠ADR心肌损伤模型，40只大鼠随机分为对照组、DH组、ADR组、DH+ADR组，各10只。对照组：连续8 d腹腔注射生理盐水0.2 ml；DH组：连续7 d腹腔注射DH 0.2 ml，第8天腹腔注射等体积的生理盐水；ADR组连续7 d腹腔注射生理盐水0.2 ml，第8天腹腔注射等体积的ADR 20 mg/kg；DH+ADR组：连续7 d腹腔注射DH 0.2 ml，第8天腹腔注射等体积的ADR 20 mg/kg。所有的动物饲养于环境温度(20±2)℃，湿度(50±10)%，按照12 h光照/12 h黑暗，自由取食，并且于第14天处理大鼠〔7〕。

1.4实验样本的收集大鼠称重，固定大鼠，摘取眼球取血，制备血清。采血后脱臼处死，迅速开胸取出心脏，称重，分离部分心脏，用于生化分析。

1.5检测指标与方法

1.5.1小鼠症状与体征观察大鼠的精神状况、饮食、体表和体重等。

1.5.2心肌组织中LDH和CK活性的测定称取部分心肌组织加预冷的生理盐水，制备5%的心肌组织匀浆。将组织样品在冰浴下剪碎，保持低温环境使用组织粉碎机分3次粉碎组织，20 s/次，并用预冷的生理盐水冲洗粉碎机的搅拌器，尽可能减少组织损耗；然后用超声波组织细胞粉碎机再进行2次粉碎，8 s/次；最后按比例补充预冷的生理盐水，4℃离心5 min，吸取上清得终浓度5%的组织匀浆。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定组织匀浆中的蛋白含量。使用LDH和CK试剂盒，并参照说明书方法测定并换算LDH、CK的活力(U/mg)。

1.5.3心肌组织中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的测定按照以上方法，将组织匀浆，离心，收集上清，最终制备5%的组织匀浆，测定蛋白质的含量。使用SOD、GSH-Px、CAT和MDA试剂盒，参照说明书检测组织匀浆并换算其SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.5.4细胞线粒体膜电位(△Ψm)的检测分离心肌组织，剪碎，胰酶消化，含血清的完全培养基终止消化，离心5 min制备并收集心肌细胞。100 μl PBS重悬细胞，加入0.5 mg/ml罗丹明123母液5 μl，37℃孵育30 min，离心5 min，弃上清，500 μl PBS洗2次后重悬细胞，避光，立即应用流式细胞分析系统进行定量检测。

1.6统计学方法采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1大鼠的生理状况在进行ADR腹腔注射前，对照组、DH组、ADR组、DH+ADR组中大鼠摄食、活动、粪便等一般情况良好，皮毛光滑。各组间体重无显著差异。开始给予ADR 5 d后，发现ADR组中大鼠均出现不同程度的脱毛、腹泻的状况，大鼠进食进水量大量减少，然而与DH预处理组相比，体重显著增加(P<0.01)。表明，DH对ADR引起的生理状况变化具有保护作用。见图1。

2.2大鼠心肌组织中LDH和CK的变化大鼠经ADR处理后，其LDH、CK活性明显增加，大鼠经DH预处理组的LDH、CK活性明显减低。表明DH对ADR引起的心肌细胞损伤有很强的保护作用。见表1。

2.3大鼠心肌组织中MDA含量的变化与对照组相比，ADR处理组心肌细胞内的MDA 含量显著增高。DH预处理大鼠后，细胞内MDA的含量显著降低。表明DH预处理抑制ADR引起的氧化应激。见表1。

与对照组比较：1)P<0.01；与ADR组比较：2)P<0.01 图1　DH对ADR处理大鼠体重的影响

表1DH对ADR处理大鼠心肌组织中各项指标的影响

指标对照组DH组ADR组DH+ADR组LDH(U/mg)43.51±2.1543.37±2.4289.19±5.251)54.56±3.171)3)CK(U/mg)3.57±0.623.28±0.316.07±0.791)3.23±0.351)3)MDA(nmol/mg)11.01±1.0610.87±0.9220.17±1.561)14.78±1.111)2)SOD(U/mg)117.78±6.87109.99±6.2550.68±4.231)83.79±7.121)2)CAT(U/mg)131.07±7.99129.82±8.1039.78±4.641)76.09±6.691)2)GSH-Px(U/mg)353.78±20.31360.37±19.16134.78±6.891)291.78±11.151)2)Δψm381.78±16.89372.86±17.41173.13±7.361)298.87±11.621)2)

与对照组比较：1)P<0.01；与ADR组比较：2)P<0.05，3)P<0.01

2.4大鼠心肌组织中SOD、CAT和GSH-Px活性的变化与对照组相比，模型组中SOD、CAT和GSH-Px的活性显著降低。DH预处理组与模型组相比，各酶活性均有升高，SOD、CAT和GSH-Px的活性显著增加。表明DH能增强ADR处理大鼠的心肌抗氧化能力。见表1。

2.5大鼠心肌组织中△Ψm的变化模型组线粒体膜电位△Ψm显著下降，而DH+ADR组中△Ψm显著增加。表明DH减轻ADR引起的心肌损伤，与其保护△Ψm有关，见表1。

3讨论

自由基是人体正常的代谢产物，正常情况下机体内的自由基是处于不断产生与消除的动态平衡中。过量产生氧自由基所导致的氧化损伤是ADR引起心脏毒性的主要原因，而线粒体呼吸链又是自由基产生的主要部位，故其本身易成为自由基损伤的主要靶点〔8〕。本研究采用急性ADR心肌损伤大鼠模型，考察了DH对ADR心肌损伤的影响，进一步研究其对氧化损伤和线粒体的保护作用〔9〕。

SOD、CAT、GSH-Px 是机体内清除氧自由基的重要抗氧化酶，两者活力的高低分别反映了机体内源性清除超氧阴离子及过氧化氢的能力，而过氧化氢在ADR心肌毒性中似乎起着更突出的作用〔10，11〕。SOD 是体内清除自由基的关键酶，也是重要的抗氧化酶之一，研究表明，随着年龄的增长，SOD清除氧自由基的能力逐渐下降，引起不饱和脂肪酸氧化生成过氧化物，使DNA、蛋白质和酶等改变、破坏从而加速衰老。SOD 通过催化超氧阴离子歧化为H2O和O2，从而达到清除自由基，抗衰老的作用〔12〕。一般认为，SOD对维护机体活性氧ROS的低水平是必要的，而GSH-Px则对防止体内自由基引起的膜脂质过氧化尤其重要〔13〕。GSH-Px 是机体一种抗氧化的重要酶，它特异地催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化物的还原反应。GSH-Px不直接清除自由基，其作用在于阻断由过氧化物引发的自由基对肌体的损害，保护细胞膜免受过氧化的损伤。GSH-Px 亦可与CAT 协同作用，催化对生物体有害的H2O2的分解，以减少自由基和过氧化脂质的形成〔14〕。尽管CAT 不能直接清除·OH，但其可以降低过氧化氢的浓度，从而起到减轻氧化应激损伤〔15〕。因此检测心肌组织中的这些抗氧化物酶(SOD、CAT、GSH-Px)的活性可以反映组织中抗氧化防御能力的变化。理论上，氧自由基理论中的ADR引起的心脏毒性必然导致过氧化物酶的过量消耗，继而组织内酶的活力可能会明显下降〔16〕。本实验结果验表明DH处理对ADR引起的大鼠心肌损伤具有保护作用，且进一步研究发现该保护作用与其提高大鼠心肌组织抗氧化防御能力有关。

本研究中发现，DH的发挥心肌保护作用的同时，对心肌的线粒体具有保护作用。ADR急性心脏毒性还有一个机制就是线粒体途径，通过线粒体膜电位Δψm的降低，继而诱导线粒体钙离子通透性转换通道(mPTP)孔的开放，从线粒体基质将钙释放，导致线粒体生物能量衰竭而心肌细胞严重损伤甚至凋亡〔17，18〕。本实验印证了ADR能引起心肌细胞线粒体的膜电位Δψm的下降，同时，DH能显著抑制Δψm的下降。由此可知，DH对心脏毒性的保护作用可能与保护线粒体功能，稳定Δψm有关。本研究说明DH能通过提高抗氧化防御能力对ADR引起的心脏毒性具有保护作用。

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〔2012-12-01修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)