郭润民+刘畅+吴子君+姜佳美+吴斌+莫海亮+黄瑞娜+何松坚+李腾+闫海+李上海+游琼+吴铿

[摘要]目的筛选糖尿病心肌病患者血清差异表达的microRNA（miRNA），明确miR-186-5p和miR-516a-5p在DCM发生发展中的作用和机制。方法选择30例DCM患者为实验组，60例年龄相当的身体健康者为正常对照组，分别从两组随机选取3例作为研究对象行microRNA芯片初筛差异表达miRNA，然后荧光定量qPCR验证这些miRNA的差异表达；在高糖诱导人AC16心肌细胞损伤模型中，miR-186-5p和miR-516-5p的mimics和inhibitors分别干预，观察对高糖引起的心肌细胞毒性的影响。结果microRNA芯片检测发现，糖尿病心肌病患者血清有51个差异表达的miRNA，经荧光定量qPCR验证为miR-186-5p、miR-516a-5p等8个差异表达miRNA；显著高表达的miR-516-5p和明显低表达的miR-186-5p介导了高糖所致心肌细胞毒性损伤。结论糖尿病心肌病患者血清miRNA表达谱发生改变，有8个差异表达miRNA，miR-516a-5p和miR-186-5p可能参与糖尿病心肌病的心肌损伤发病过程。

[关键词]microRNA；糖尿病；糖尿病心肌病；心肌损伤

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是独立于高血压、冠心病及心脏瓣膜病变的一种糖尿病心脏并发症，与糖尿病患者心血管疾病的高发生率及高病死率密切相关，越来越受到重视。糖毒性、脂毒性、氧化应激、线粒体功能障碍、内质网应激、心肌细胞凋亡、炎症等众多因素与DCM心肌损伤密切相关，其中心肌细胞凋亡与炎症是DCM的主要发病机制之一，然而具体分子机制尚不清楚。

MicroRNA（miRNA）是22-24nt的一种非编码RNA，能通过碱基配对的方式特异性结合目的mRNA 3非编码区域负性调控其表达，在细胞分化、增殖、代谢、细胞凋亡和迁移等生物学活动中发挥一定作用。新近研究表明：MicroRNA在心脏纤维化、心律失常、心肌缺血、心衰等心脏疾病中具有重要作用；体内外实验研究提示，MicroRNA表达异常可能在糖尿病心肌病发病机制中起到重要作用。

因此，为了深入阐明DCM心肌损伤的发病机理，为了明确MicroRNA在DCM心肌损伤中的具体作用与机制，本研究拟采用microRNA芯片筛选DCM患者血清差异表达miRNA，并且荧光定量qPCR验证之；在高糖诱导人ACl6心肌细胞损伤模型中，使用miRNA的mimics和inhibitors分别干预，观察对高糖引起的心肌细胞毒性的影响。

1材料与方法

1.1材料

D-葡萄糖购自美国Sigma-Aldrich公司。胎牛血清（GIBICO），DMEM培养基（Hyclone），青链霉素（Hyclone），胰酶（Hyclone），PBS磷酸钾缓冲液（Hyclone）。miR-186-5p inhibitor、miR-186-5pmimics、miR-516a-5p inhibitor、miR-516a-5p mimics（广州锐博生物科技有限公司），miRcnte miRNA提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcnte miRNA荧光定量检测试剂盒（TIANGEN），Lipofectamine

3000 Transfection Reagent（Invitrogen公司），Opti-MEM培养基（Invitrogen公司），CCK-8（碧云天），30%丙烯酰胺混合溶液（碧云天）。人microRNA芯片版本为agilent V19。

1.2方法

1.2.1纳入研究的DCM患者一般资料与血液样本采集选择2012年6月～2015年7月期间在广东医学院附属医院心血管内科住院的糖尿病心肌病患者30例，健康组60例。诊断标准参照以往文献报道，具体如下：（1）确诊糖尿病病程5年以上；（2）心脏扩大、心力衰竭、心绞痛或心律失常存在；（3）无冠状动脉大小血管和微血管病变；（4）无其他原因的心肌病和心脏病。排除标准如下：（1）急性脑梗死患者；（2）自身免疫性疾病；（3）使用激素或免疫抑制剂者；（4）发病前2周有炎症、感染性疾病；（5）依从性差不能完成相关指标测定的患者。本研究经广东医学院附属医院伦理委员会审核通过，参与本研究的所有患者均签署了知情同意书。采集DCM患者外周静脉血10mL，将其置于不含抗凝剂的收集管中，室温静置30min后，4000r/min离心20min，离心留取上清低温冰箱保存备用。

1.2.2人MicroRNA芯片筛查与qPCR验证采用人microRNA芯片（agilent V19）筛查DCM患者和健康对照各3例血清microRNA表达差异；采用TIANGEN公司miRNA的分离提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒和荧光定量检测试剂盒行qPCR验证DCM患者血清与高糖处理心肌细胞差异表达microRNA。

1.2.3细胞培养与实验干预人ACl6心肌细胞购自ATCC，10%胎牛血清的DMEM培养基置于5%C02、37℃的温箱中培养。实验分为两组：对照组，高糖组（35mmol/L葡萄糖作用24h或48h）。细胞株传代96孔板上，待其融合度约为50%～70%时，采用Lipofectamine 3000 Transfection Reagent转染miRNA mimics或inhibitor，于培养箱中孵育4h后更换培养基，24h后进行microRNA的检测。

1.2.4人AC16心肌细胞存活率的测定人AC16心肌细胞接种于96孔培养板中，当细胞生长到培养孔的约80%面积时，根据实验需要进行不同的处理，每个处理因素设3个复孔。终止培养后，每孔加入100μL CCK-8工作液，轻摇，37℃孵育2h，用Muhiskan MK3酶标仪（Thermo Fisher Scientific Inc，USA）（入=450mm）记录各孔的吸光度（OD）。取3孔OD值的平均数，按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=处理组OD/对照组ODx100%，重复3次。

1.3统计学处理

统计分析用SPSS15.0软件进行，计量资料以（x±s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），用LSD-t进行均数之间的比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MicroRNA芯片筛查DCM患者血清差异表达miRNA

为了探明糖尿病心肌病患者血清差异表达microRNA，首先使用microRNA芯片（agilent V19）筛选出了DCM患者血清51种差异表达microRNA（n=3），发现miR-516a-5p、hsa-miR-575和hsa-miR-630等明显升高，hsa-miR-144-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-30d-5p等显著降低。与健康对照组比较，P<0.05，fold change为差异倍数。见图1。

2.2荧光定量qRT-PCR验证DCM患者血清差异表达miRNA

为了验证microRNA芯片筛选结果，采用荧光定量qRT-PCR测定30例DCM患者和60例健康对照血清与高糖处理的ACl6心肌细胞microRNA表达，结果均显示：8种microRNA表达水平变化显著，hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-1 86-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-30d-5p下降明显（P<0.05），hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-575和hsa-miR-630增加显著（P<0.05），其中hsa-miR-186-5p下调和hsa-miR-516a-5p增加最为显著。见图2。（A和B）通过qRT-PCR检测DCM患者（n=30）和正常人（n=60）血清中miR-516a-5p的表达水平。（C和D）通过qRT-PCR检测分析不同处理的AC16细胞中miR-516a-5p的表达水平。与对照组相比（"P<0.05）。

2.3 miR-516a-5p和miR.m186-5p在高糖诱导心肌细胞损伤中的作用

为了探究差异表达曲microRNA尤其是miR-516a-5p和miR-186-5p在DCM心肌损伤中的作用，分别采用miR-516a-5p和miR-186-5p的mimics和inhibitors干预，观察对高糖处理的AC16心肌细胞损伤的影响。使用CCK-8测定AC16心肌细胞存活率，结果显示：miR-516a-5p的inhibitors和miR-186-5p的mimics能抑制高糖诱导的心肌细胞损伤，另一方面，miR-516a-5p的mimics和miR-186-5p的inhibitors却能促进高糖诱导的心肌细胞损伤。提示了表达失调的microRNA尤其是表达上调的miR-516a-5p和表达下调的miR-186-5p介导了DCM心肌损伤的发病过程。见图3。

3讨论

糖尿病心肌病是由糖尿病引起的心脏微血管病变以及心肌代谢紊乱所致的心肌细胞死亡，通常表现为心肌收缩和舒张功能下降甚至心力衰竭，独立于高血压、冠心病及心脏瓣膜病变等的主要心脏并发症之一。近年来，糖尿病的发病率逐年升高，DCM发病率和危害性极高，是糖尿病患者心血管疾病的高发生率及高病死率的主要病因，引起全世界的广泛关注。许多研究表明：糖毒性、脂毒性、氧化应激、线粒体受损、心肌细胞凋亡、炎症等是DCM的发病因素，但是确切的分子机制不详。

MicroRNA（miRNA）是一种长度大约22-24nt的非编码RNA，已发现大约2500多种人类miRNA，这些miRNA至少调控30%以上的基因，在细胞分化、增殖、代谢、细胞凋亡、迁移和坏死等生物过程中发挥重要作用。最近的研究表明，microRNA在各种心脏疾病，包括心脏纤维化、心肌肥厚、心律失常、心肌缺血、心衰中发挥重要的作用。体内外实验研究结果提示，microRNA表达异常在糖尿病心肌病心肌损伤中可能起重要作用。因此，明确DCM患者差异表达microRNA及其作用机制，对于DCM的发病机制、早期诊断和防治有重要意义。

本研究microRNA芯片的结果显示：在DCM患者血清中有多种miRNA不同程度的上调或下调，8种microRNA表达水平变化显著，hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-30d-5p下降明显，hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-575和hsa-miR-630增加显著，其中hsa-miR-186-5p上调和hsa-miR-516a-5p下降最为显著。本研究及其他学者的研究均证实，表达失调的miRNA在糖尿病患者心血管并发症的发生发展中有重要作用。此外，表达异常的miRNA在高糖诱导心肌细胞损伤中同样有重要作用。

为了明确这些表达显著异常的miRNA（尤其是hsa-miR-186-5p和hsa-miR-516a-5p）在DCM心肌损伤中的具体作用与机制，本研究采用33raMD-glucose处理人ACl6心肌细胞48 h模拟机体心脏糖毒性，进而分别使用miR-186-5p和miR-516a-5p inhibitor和mimics预处理，观察对高糖环境对心肌细胞存活率的影响。研究结果显示：与体内miRNA芯片和qPCR验证结果类似的是，33mMD-glucose处理48h后，人AC16心肌细胞miR-186-5p水平也显著下降、miR-516a-5p表达水平明显增加；应用各自的inhibitor和mimics预处理后，miR-5 16a-5p的mimics、miR-186-5p的inhibitor的能促进高糖诱导的心肌细胞损伤，miR-186-5p的mimics、miR-516a-5p的inhibitor的能抑制高糖诱导的心肌细胞损伤。这些研究结果提示：上调的miR-186-5p和下调的miR-516a-5p介导了DCM心肌损伤，进一步验证了表达异常的miRNA在DCM心肌细胞损伤中有重要作用。

综上所述，DCM患者血清中至少有8种microRNA表达水平变化显著，其中hsa-miR-186-5p上调和hsa-miR-516a-5p下降最为明显，差异表达的miRNA（尤其是hsa-miR-186-5p和hsa-miR-516a-5p）在DCM心肌损伤中有重要作用。单独或者联合筛查这些差异表达的miRNA在早期诊断和防治DCM中的作用有待深入研究。