张少强

（本溪县林业局，辽宁 本溪 117100）

芍药种子萌发抑制物的生物测定及分析鉴定

张少强

（本溪县林业局，辽宁 本溪 117100）

本文通过生物测定、系统分离及GC-MS鉴定的方法对芍药种子中的萌发抑制物进行了研究。结果表明，芍药种子中存在萌发抑制物；芍药种子系统分离相的抑制作用从强到弱依次为C相＞B相＞D相＞A相，B、C、D各相对种子的萌发率和胚根生长均有显著影响；芍药种子系统分离相的B相中所含有的抑制物质为2，4-二叔丁基苯酚和乙烯，C相中所含有的抑制物质为2，4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯和邻苯二甲酸二丙酯，D相中所含有的抑制物质为2，4-二叔丁基苯酚。

芍药；种子；萌发；抑制物

芍药（Paeonia lactiflora）为芍药科芍药属多年生草本植物。芍药在长期的系统演化过程中形成了独特的上下胚轴双重休眠特性[1]，自然条件下从播种到出苗需要6～7个月的时间[2]，生长周期长，给芍药的人工栽培和种子检验带来很大的困难。

萌发抑制物是导致芍药种子休眠的一个重要因素。目前，关于种子中萌发抑制物质的研究已有相当多的报道，但多数研究只停留在对抑制物的初步提取与分离水平上，达到鉴定水平的较少，芍药属植物种子内源抑制物的研究也处于初级阶段。关雪莲等[3]在对新疆块根芍药种子萌发特性进行研究时发现芍药种皮和种胚浸提液对白菜种子萌发和幼苗建成都有影响，这可能是种皮和种胚都含有萌发抑制物质所致。张荣荣等[4]在对芍药内源抑制物质活性的研究中发现，去胚乳的胚在10 d左右就能长出胚根，当胚根休眠打破后，子叶或胚中抑制胚芽萌动的激素占主导，各部位抑制作用大小为：胚乳＞胚（子叶）＞种皮。本试验对芍药种子中萌发抑制物的生物测定、系统分离及分析鉴定进行了研究，旨在为探讨芍药种子休眠原因，揭示芍药种子休眠机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所需的芍药种子于2010年9月购自甘肃牡丹园艺公司，种子净度为95.3%，千粒重为150.86 g，含水量为36.03%。生物活性测定所用白菜种子，纯度为92%，净度为95%，发芽率为80%以上。

1.2 试验方法

1.2.1 芍药种子萌发抑制物的生物测定

取芍药种子6 g，用预冷的80%甲醇冰浴研磨，4℃浸提48 h，抽滤，重复两次，合并滤液，35℃减压蒸干，加入6 mL甲醇，分别配置成浓度为0.2 g/mL、0.4 g/mL、0.6 g/mL、0.8 g/mL、1.0 g/mL的浸提液。

分别取上述不同浓度的浸提液2 mL置于直径为9 cm的培养皿中（对照以相同体积的蒸馏水代替），放置100粒白菜种子，白菜种子用前在35℃温水中浸泡15 min，每处理3次重复，放于25℃恒温培养箱中培养，48 h后统计白菜种子的发芽率，72 h后测量胚根长。所得数据通过SPSS软件进行统计分析。

1.2.2 芍药种子萌发抑制物的分离及生物测定

取芍药种子4 g，用预冷的80%甲醇冰浴研磨，4℃浸提48 h，抽滤，重复两次，合并滤液，35℃减压蒸干，然后加入4 mL的甲醇（浓度为1 g/mL），采用系统分离的方法分离提取萌发抑制物，见图1。

将A相、B相、C相、D相提取液在35℃条件下减压蒸干，然后定容至4 mL，分别取2 mL置于直径为9 cm的培养皿中（对照以同体积的蒸馏水代替），待乙醚挥发至干后，每个培养皿加入2 mL蒸馏水，进行白菜种子萌发试验，方法同1.2.1。

1.2.3 芍药种子萌发抑制物的分析鉴定

取6 g芍药种子，用预冷的80%甲醇冰浴研磨，4℃浸提48 h，抽滤，重复两次，合并滤液，35℃减压浓缩蒸干，然后加入6 mL甲醇定容，按照1.2.2的系统分离方法分离得到A相、B相、C相、D相萃取液。取B相、C相、D相萃取液于沈阳农业大学分析测试中心进行GC-MS鉴定。

2 结果与分析

2.1 芍药种子萌发抑制物的活性分析

芍药种子甲醇浸提液对白菜种子萌发率和胚根生长的影响见表1。

表1 芍药种子甲醇浸提液对白菜种子萌发的影响

由表1可知，浸提液浓度为0.2 g/mL时，白菜种子的萌发率为92.00%，与对照90.00%接近；浸提液浓度为0.4 g/mL、0.6 g/mL时，白菜种子的萌发率略有减小；浸提液浓度增加到0.8 g/mL时，白菜种子的萌发率明显降低，为64.00%；浸提液浓度为1.0 g/mL时，白菜种子萌发率为66.00%，虽略有上升但变化不大。5种浓度浸提液对白菜种子胚根生长的影响均较大，胚根长度与对照相比较短，并随着浸提液浓度的增大逐渐变短，分别为2.18 cm、1.15 cm、1.17 cm、0.92 cm、0.88 cm。

方差分析结果表明，浓度为0.2 g/mL的浸提液对白菜种子萌发率的影响与对照相比无显著差异；浓度为0.4 g/mL和0.6 g/mL的浸提液对白菜种子萌发率的影响与对照相比差异显著，但两者相比没有显著差异；浓度为0.8 g/mL和1.0 g/mL的浸提液对萌发率的影响与对照、0.4 g/mL和0.6 g/mL的浸提液相比都有显著差异，但两者之间差异不显著。浓度为0.2 g/mL的浸提液对白菜种子胚根长的影响与对照相比差异显著；浓度为0.4 g/mL、0.6 g/mL、0.8 g/mL、1.0 g/mL的浸提液对白菜种子胚根长的影响与对照和0.2 g/mL的浸提液相比均有显著差异，但四者相比差异不显著。可见，芍药种子的甲醇浸提液中存在萌发抑制物质，且随着浸提液浓度的增大，抑制作用逐渐增强。

2.2 芍药种子萌发抑制物的分离及生物测定结果

对芍药种子的甲醇浸提液进行系统分离得到4种分离相，各相对白菜种子的发芽率和胚根生长影响见表2。

表2 芍药种子提取液各分离相对白菜种子萌发的影响

由表2可知，白菜种子在A相萃取液培养条件下发芽率与对照接近，而B相、C相、D相萃取液培养条件下白菜种子发芽率均明显小于对照。A相、B相、C相、D相对于白菜种子胚根生长的影响也呈现相似的趋势，其中，以A相萃取液培养条件下胚根生长最长，B相、D相次之，C相最短。

方差分析结果表明：就萌发率而言，A相萃取液对白菜种子的萌发率影响不大，与对照相比没有显著差异；B相、D相萃取液对白菜种子萌发率有一定影响，与A相萃取液和对照相比有显著差异，但B相、D相萃取液之间差异不显著；C相萃取液对萌发率的影响结果与B相、D相萃取液相比有显著差异。因此，对白菜种子萌发率抑制作用从强到弱依次为C相、B相、D相、A相萃取液和对照。而对于胚根长而言，所表现的差异水平一致，即A相、B相、C相、D相萃取液对白菜种子胚根长的影响与对照相比均有显著差异，并且D相与A相、B相与D相、C相与B相，两两之间的差异也达到显著水平。因此，对白菜种子胚根长的抑制作用从强到弱依次为C相萃取液、B相萃取液、D相萃取液、A相萃取液、对照。

2.3 芍药种子萌发抑制物的分析鉴定结果

鉴于B相、D相、C相萃取液对白菜种子生长具有较强的抑制活性，对芍药种子的B相、C相、D相萃取液中含有的萌发抑制物质用GC-MS分析鉴定。

2.3.1 B相萃取液的鉴定结果

采用GC-MS分析法鉴定了B相萃取液的浓缩样品，得到离子流程图（图2），共有100个峰，对离子流程图中峰面积和Qual值较大的化合物进行鉴定，共鉴定出26种，分别是：环己基二甲氧基甲基硅烷、十二烷、正十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、二十烷、正二十一烷、二十二烷、正二十五烷、正二十七烷、四十三烷、5-乙基-2-甲基辛烷、2，4-二甲基十一烷、4，6-二甲基十二烷、2，6，11-三甲基十二烷、4-乙基十四烷、3-甲基十五烷、3-甲基十六烷、2，6，10，14-四甲基十六烷、8-甲基十七烷、2-甲基十八烷、2，4-二叔丁基苯酚、乙烯。

2.3.2 C相萃取液的鉴定结果

采用GC-MS分析法鉴定了C相萃取液的浓缩样品，得到离子流程图（图3），共有100个峰，鉴定出化合物25种，分别是：环己基二甲氧基甲基硅烷、十二烷、十五烷、十六烷、正十九烷、二十烷、二十二烷、正二十一烷、二十四烷、正二十五烷、正二十七烷、正二十八烷、正三十烷、四十四烷、3-甲基癸烷、3，7-二甲基癸烷、2，4-二甲基十一烷、

2，6，10，14-四甲基十五烷、3-甲基十六烷、

2，6，10，14-四甲基十六烷、9-辛基十七烷、2，4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丙酯。

2.3.3 D相萃取液的鉴定结果

采用GC-MS分析法鉴定了D相萃取液的浓缩样品，得到离子流程图（图4），共有70个峰，鉴定出化合物22种，分别是：环己基二甲氧基甲基硅烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、二十烷、正二十一烷、二十二烷、正二十五烷、正二十六烷、正三十烷、正三十六烷、3，7-二甲基癸烷、2，9-二甲基十一烷、3-甲基十二烷、2，6，10，14-四甲基十五烷、8-甲基十七烷、9-辛基十七烷、2，6，11-三甲基十二烷、2，6，10，14-四甲基十六烷、碘代十八烷、2，4-二特丁基苯酚。

3 结论与讨论

本试验通过甲醇浸提液对白菜种子萌发情况的影响得出，芍药种子中存在萌发抑制物，且抑制物的浓度越大，其抑制作用越强。参照南方红豆杉种子浸提液的分离方法[5]，对芍药种子浸提液进行系统分离，得到A相、B相、C相、D相。这4种分离相对白菜种子的萌发和胚根生长均有抑制作用。其中，A相萃取液的抑制作用最弱，在对芍药种子浸提液的分离相进行分析鉴定时，只对B相、C相、D相进行了分析鉴定。

对芍药种子系统分离相中所含有的萌发抑制物质进行GC-MS鉴定，B相中鉴定出26种化合物，C相中鉴定出25种化合物，D相中鉴定出22种化合物。目前，已知的天然的发芽抑制物大体可以分为几类，大多数是一些简单的低分子量有机化合物，其中最简单的且具挥发性的有HCN、NH3及乙烯；此外，还有醛类化合物、酚类化合物、酯类化合物、生物碱类。除此之外，还有阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸和脱落酸等。因此，推测B相萃取液的浓缩样品含有的萌发抑制物为2，4-二叔丁基苯酚和乙烯；C相萃取液含有的萌发抑制物为2，4-二特丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丙酯；D相萃取液含有的萌发抑制物质为2，4-二叔丁基苯酚。

本试验在B相、C相、D相中虽然发现了萌发抑制物质，但是这些抑制物质究竟存在于种子中的哪个部位及具体含量是多少，还有待于进一步研究。

[1]李嘉珏.中国牡丹与芍药[M].北京:中国林业出版社，1999.

[2]杨洋.芍药种子萌发的生物学特性及破眠技术的研究[D].哈尔滨:东北林业大学，2009.

[3]关雪莲，周桂玲，盛方.新疆块根芍药种子萌发特性研究[J].种子，2009，28（5）:97-99.

[4]张荣荣，王康才.芍药种子内源抑制物质活性的研究[J].中草药，2008，39（12）:1880-1883.

[5]于海莲.南方红豆杉种子休眠机理及催芽技术的研究[D].北京:北京林业大学，2009.

Bioassay and Analytical Appraisal of the Seed Germination Inhibitors of Paeonia lactiflora

ZHANG Shaoqiang
(Forestry Bureau of Benxi County,Benxi 117100,Liaoning,China)

In this paper the seed germination inhibitors of Paeonia lactiflora were studied by the means of bioassay, systematic separation and GC-MS appraisal.The results showed that there were germination inhibitors existing in Paeonia lactiflora seeds and the sequence of the inhibiting effects of the seed systematic separation phases was C＞B＞D＞A,and the phases of B,C and D have significant effects on their seed germination rates and radicle growth;the inhibitors in the seed systematic separation phase B were 2,4-Ditertbutyl hydroquinone and ethylene，the inhibitors in phase C were 2,4-Ditertbutyl hydroquinone,Dibutyl phthalate,diisobutyl phthalate and Di-propyl ortho-phthalate and the inhibitor in phase D was 2,4-Ditertbutyl hydroquinone.

Paeonia lactiflora;Seeds;Germination;Inhibitors

S682.19

A

2095-0152（2015）03-0017-04

2015-04-01

2015-05-08

张少强（1969- ），男，高级工程师，研究方向：森林经营。E-mail：bxxcyb@163.com

杨婷婷）