王建昌，王金凤，段永生，李 静，陈志敏，陈瑞春*

（河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北 石家庄 050051）

基于内参的大肠埃希氏菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

王建昌，王金凤，段永生，李 静，陈志敏，陈瑞春*

（河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北 石家庄 050051）

针对大肠埃希氏菌O157∶H7 rfbE和Flic靶基因保守序列，设计特异性引物和探针，优化反应体系，并加入内参（internal amplification control，IAC），建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应（polymease chain reaction，PCR）检测方法。结果表明，该方法对E. coli O157∶H7基因组DNA的最低检测限为1 pg/μL；对含有靶基因质粒的最低检测限为103copies/μL；对细菌的最低检测限为5×103CFM/mL；Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系（R2=0.999）。人工污染实验结果表明，在初始菌量为7 CFM/25 g时，采用水洗加试剂盒法提取DNA，E. coli O157∶H7在增菌6 h后即可检出；而采用水煮法提取DNA，则在增菌10 h后方可检出。建立的E. coli O157∶H7实时荧光定量PCR方法，既能有效检测食品中O157∶H7，又能实时监测PCR反应过程，有效防止“假阴性”的发生。

大肠埃希氏菌O157∶H7；rfbE；Flic；实时荧光定量PCR；内参

大肠埃希氏菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7，E. coli O157∶H7）是肠出血型大肠埃希氏菌的一种主要血清型，可引起人出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征以及血栓形成性血小板减少性紫癜等[1]，是一种危害严重的食源性病原微生物。E. coli O157∶H7广泛分布于自然界，严重威胁公众健康[2]。该菌在猪、牛粪便及猪肉、牛肉[3]中分离率极高，其引起的疾病也与食用未烘烤的饼干面团[4]、生菜[5]等有关。E. coli O157∶H7多暴发于发达国家，在美国和加拿大监测的肠道致病菌中，该菌分别排在第2位和第3位。……