闫云峰 杨劲松

1）郑州市直机关医院内科 郑州 450000 2）郑州大学实验动物中心 郑州 450052

盐酸多奈哌齐对血管性痴呆模型大鼠大脑NO及iNOS的影响

闫云峰1）杨劲松2）

1）郑州市直机关医院内科 郑州 450000 2）郑州大学实验动物中心 郑州 450052

目的 观察盐酸多奈哌齐（DP）对血管性痴呆模型大鼠iNOS表达的影响，探讨其抗血管性痴呆的作用及机制。方法 将SD大鼠随机分为假手术组、实验对照组、DP治疗组，每组大鼠20只，采用双侧颈总动脉结扎法制作血管性痴呆大鼠模型。DP干预治疗后，用“Y”型迷宫检测大鼠学习记忆能力，比色法检测大鼠大脑NO及NOS的表达。结果 与实验对照组比较，DP治疗后VD大鼠学习记忆能力明显提高，海马iNOS表达明显减少（P＜0.01）。结论 盐酸多奈哌齐可改善学习记忆能力，其机制可能是通过下调iNOS的过度表达，减少NO的生成，抑制神经细胞损伤。

血管性痴呆；大鼠；iNOS；盐酸多奈哌齐；学习；记忆

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是指在缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性脑血管疾病引起的脑组织损害基础上，产生的以高级神经认知功能障碍为主的一组临床综合征［1］，是继阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）后第二常见的痴呆类型。目前国内外对VD尚无有效防治手段。盐酸多奈哌齐（donepezil，DP）作为第二代胆碱脂酶抑制剂，通过可逆性非竞争地抑制乙酰胆碱脂酶和活性，改善记忆各认知功能，是目前治疗老年痴呆的首选药物，但其用于VD的治疗机制尚不明确。本实验通过观察VD大鼠iNOS的表达，探讨iNOS在DP治疗VD大鼠认知障碍中所起作用及可能机制。

1 对象和方法

1.1 对象 筛选Y迷宫学习达标的10月龄健康雄性SD大鼠60只（体质量250～280g），清洁级，动物随机分为假手组、实验对照组、DP治疗组每组20只。DP治疗组以水合氯醛经腹腔麻醉后行颈正中切口，仔细分离肌肉，分离出双侧颈总动脉并埋线结扎，缝合伤口。假手术组在手术中分离出双侧颈总动脉，埋线后将手术线抽出，然后缝合伤口。将DP 以0.1mg/mL用生理盐水配制，DP治疗组每天以1mg/kg的剂量灌胃，假手术组给予同等量生理盐水灌胃。造模后30 d，应用Y迷宫测试对各组大鼠进行学习记忆能力测试，每组随机取10只大鼠进行免疫组化实验，另取10只大鼠取脑组织制成脑组织匀浆液测定NO和iNOS含量。

1.2 方法

1.2.1 学习记忆能力测试：采用Y迷宫测试，选取错误反应次数（error number，EN）及全天总反应时间（total reaction time，TRT）作为观察指标。

1.2.2 NO含量、iNOS活力测定：造模后第30天，各组大鼠用水合氯醛麻醉，取血后，快速剖出全脑，去除软脑膜血管、脑干及小脑。称质量，放入低温冰箱。用脑组织重量9倍的生理盐水和脑组织放入匀浆机研碎，制成10％的脑组织匀浆液，3 000～4 000r/min离心10min，取上清液，严格按照NO含量、iNOS活性试剂盒的操作步骤进行测定。NO含量单位为微摩尔/克蛋白（μmol/gprot），iNOS活性定义为每毫克组织蛋白每分钟生成的1nmol NO为一个单位，即nmol/min·mg。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，计数资料以百分率（％）表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 手术对大鼠存活能力及运动能力的影响 各组大鼠在术后早期均出现运动减少，爬行时后肢呈“八”字，有共济失调，转圈现象，术后5～7d爬行基本恢复，无明显运动障碍。假手术组活动多在3～5d后恢复正常，与假手术组大鼠相比，实验对照组术后活动能力更差，DP治疗组大鼠活动能力也差，但明显强于实验对照组。

2.2 手术对大鼠存活能力的影响 术后共死亡大鼠6只，其中，实验对照组4只，DP治疗组2只，其余各鼠生存良好。见表1。

表1 手术后大鼠死亡情况比较

2.3 手术对大鼠学习记忆的影响 Y迷宫测试发现，与假手术组比较，实验对照组大鼠全天错误次数增多，反应时间明显延长，与实验对照组比较，DP治疗组大鼠的全天错误次数减少，反应时间明显缩短，提示DP治疗改善了大鼠的学习记忆能力。见表2。

表2 各组大鼠学习记忆能力测定结果比较（±s）

表2 各组大鼠学习记忆能力测定结果比较（±s）

注：与假手术组比较，●P＜0.05；与DP治疗组比较，★P ＜0.05

组别 n EN ERT假手术组20 1.312±0.541 91.987±8.160实验对照组 16 6.062±1.245●★ 114.492±9.561●★DP治疗组18 5.550±0.593 103.546±9.024

2.4 脑匀浆NO含量、iNOS活力测定结果 模型组大鼠脑组织NO含量和iNOS活力明显高于假手术组，DP治疗组大鼠脑组织NO含量和iNOS活力明显低于模型组（P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠NO含量、iNOS活力测定结果比较（±s）

表3 各组大鼠NO含量、iNOS活力测定结果比较（±s）

注：与假手术组比较，●P＜0.05；与DP治疗组比较，★P＜0.05

组别 NO含量（μmol/gprot）iNOS活力（nmol·min-1·mg-1）假手术组1.349±0.3190 3.319±0.2470实验对照组 2.3417±0.1868●★ 4.2837±0.3801●★DP治疗组1.9478±0.2649 3.758±0.4260

3 讨论

NO是在NOS的催化下，由L-精氨酸分解为L-瓜氨酸和NO而成。NOS可分为原生型NOS（cNOS）和诱生型NOS（iNOS）。cNOS以无活性状态存在，脑缺血后造成神经损伤的NO主要由iNOS产生。iNOS是一种可溶性酶，在生理情况下，iNOS并不表达，在病理条件下，细菌内毒素及细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）、白介素-1α（IL-1α）和干扰素γ（IFN-γ）诱导巨噬细胞以及其他细胞基因转录，启动蛋白质合成，iNOS持续激活［2］，产生大量NO。高浓度的NO可通过与过氧化物产生反应生成过氧亚硝酸盐，过氧亚硝酸盐是一种半衰期较长的强有力氧化剂，它比NO和过氧化物具有更强的细胞毒性，可使细胞蛋白质、核酸及脂质发生氧化损伤［3］；高浓度的NO与Fe结合，使Fe从酶中丢失而抑制酶的活性，由此阻断细胞内能量的合成和DNA复制，产生细胞毒性作用。由于iNOS受DNA转录调节，故诱导数小时后才产生酶活力，一经诱导，可长时间保持酶的活力［3］，故而iNOS被认为是一种“病理型”的酶。

研究表明，脑缺血后的神经元损伤可导致学习记忆障碍，血管性痴呆是脑血管疾病后的并发症，大量临床研究证明，血管性痴呆发生的原因是由于一次或多次的脑梗死或其他脑血管病变造成足够的脑组织损害所致，病理检查已经证实脑血管疾病患者有足够的脑组织损害才能产生痴呆。

结果显示，术后30d对照组出现明显的学习记忆功能障碍，表现为全天错误次数增多，反应时间明显延长，而DP治疗组则学习记忆成绩明显好于对照组，表明DP能改善学习记忆能力。其机制可能与DP抑制iNOS表达，降低iNOS的活性，从而减少NO的生成，对缺血所致的NO增加有一定的拮抗作用，促进受损神经元逆向恢复，保护可以受损的神经元，减少其功能丧失，改善痴呆者的学习记忆能力。

［1］Paul RH，Cohen RA，Moser DJ，et al.Clinical correlates of cognitive decline in vascular dementia［J］.Cogn Behav Neurol，2003，16（1）：40-46.

［2］Knowles RG，Moncada S.Nitric oxide synthases in mammals［J］.Biochem，1994，298（Pt2）：249-258.

［3］Fukuyama N，Takizawa S，ishida H，et al.Peroxynitrite formation in focal cerebral iachemia-reperfusion in rats occurs predominantly in periinfarct region.［J］Cereb Blood Flow Metal，1998，18（2）：123-129

（收稿2014-05-13）

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1673-5110（2015）05-0070-02