蔡瑶俊，查小雪，宁 丹，王 囡，贾雪梅，朱德发

甲状腺素联合多奈哌齐对成年期甲状腺功能减退症大鼠额叶乙酰胆碱、munc-18的影响

蔡瑶俊1，查小雪1，宁 丹1，王 囡1，贾雪梅2，朱德发

目的观察甲状腺素联合多奈哌齐对成年期甲状腺功能减退症（简称甲减）大鼠额叶内乙酰胆碱含量以及munc-18表达的影响，探讨甲减脑额叶损伤及恢复的可能分子机制。方法采用给予含0.05%丙基硫氧嘧啶的饮用水6周建立大鼠甲减模型。自第5周起，给予多奈哌齐、甲状腺素或甲状腺素联合多奈哌齐治疗2周，采用放射免疫法检测血清甲状腺激素水平，碱性羟胺比色法测定额叶内乙酰胆碱含量，免疫组化法检测额叶内munc-18的分布与表达。结果甲减组、多奈哌齐治疗组大鼠血清三碘甲状腺原氨酸（T3）、四碘甲状腺原氨酸（T4）水平显著减低、促甲状腺激素（TSH）水平明显增加（P＜0.01），甲状腺素治疗组、联合治疗组T3、T4、TSH水平与正常对照组相比差异无统计学意义；甲减组大鼠额叶内乙酰胆碱含量下降（P＜0.05），多奈哌齐治疗组、甲状腺素治疗组、联合治疗组乙酰胆碱含量均恢复至正常水平，其中联合治疗组有进一步恢复趋势；甲减组、多奈哌齐治疗组大鼠munc-18在额叶内Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层表达下降（P＜0.05）。其中，以Ⅲ／Ⅴ层下降最为显著（P＜0.01），甲状腺素治疗组munc-18表达仍下降（P＜0.05），联合治疗组额叶内munc-18表达正常。结论多奈哌齐可以改善甲状腺功能减退引起的额叶内乙酰胆碱含量改变；甲状腺素联合多奈哌齐治疗有利于成年期甲状腺功能减退造成的额叶内胆碱含量改变和突触蛋白损伤的恢复。

甲状腺功能减退症；额叶；乙酰胆碱；munc-18；左旋甲状腺素；多奈哌齐

成年期甲状腺功能减退症（简称甲减）可引起脑部额叶损害，额叶皮质是对学习记忆很重要的脑部结构［1－2］。研究［3－4］表明甲减可以损伤额叶内突触相关蛋白的表达及胆碱能系统。脑内乙酰胆碱是中枢神经系统最重要的神经递质之一，在其释放过程中有多种突触相关蛋白的参与。munc-18是一种突触前膜胞内蛋白，参与乙酰胆碱的释放［5］，在突触囊泡“胞外排”方式分泌神经递质过程中起重要作用［6］。研究［3］表明甲减大鼠生理剂量的甲状腺素替代治疗后，脑内突触相关蛋白的损伤未完全恢复。多奈哌齐作为一种乙酰胆碱酯酶抑制剂，在改善认知功能以及神经保护方面起重要作用［7］。该研究旨在观察成年期甲减大鼠额叶内乙酰胆碱含量、munc-18表达变化以及探讨甲状腺素联合多奈哌齐治疗的恢复效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只健康成年雄性SD大鼠，普通级，体重260～300 g，购自南京实验动物中心。常规条件下喂养，自然采光，自由接受标准锯齿类动物食物以及饮水。实验遵循《安徽医科大学实验用动物管理和使用指南》。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 仪器 DXM1200F光学显微镜（日本Nikon公司）；DFM296型16管放射免疫计数器（合肥众成机电技术开发有限公司）；JEDR 801D形态学图像分析系统（江苏捷达科技发展有限公司）；酶标仪（美国Biote仪器有限公司）。

1.2.2 试剂 丙基硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）、左旋甲状腺素（levothyrocine，L-T4）、多奈哌齐（美国Sigma公司）；三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、四碘甲状腺原氨酸（tetraiodothyronine，T4）、促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）放射免疫试剂盒（北京北方生物技术研究所）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司）；DAB染色试剂盒、SP-0022生物素标记羊抗兔IgG SP超敏试剂盒（北京博奥森公司）；抗munc-18蛋白多克隆抗体（美国BD公司）。

1.3 动物模型建立大鼠适应性喂养1周，随后将其随机均分为5组：正常对照组、甲减组、多奈哌齐治疗组、甲状腺素治疗组、联合治疗组。正常对照组自由饮水，余下4组给予含0.05%PTU饮用水6周制备甲减模型。第5周起，多奈哌齐治疗组每日在

饮用水中加0.005%多奈哌齐，甲状腺素治疗组每日腹腔注射给予L-T4 6 μg／100 g体重，联合治疗组每日予饮用水中加入0.005%多奈哌齐以及腹腔注射L-T4 6 μg／100 g体重。同时，正常对照组、甲减组、多奈哌齐治疗组每日腹腔注射给予等量的无菌生理盐水。各组大鼠每周称重1次，根据体重调整给药剂量，治疗时间2周。

1.4 标本制备腹主动脉采血待测T3、T4、TSH。取血后将大鼠断头处死，于冰台迅速取分离大脑额叶部位组织，左侧额叶放置于－80℃冰箱储存待测乙酰胆碱含量，右侧额叶浸泡于4%的多聚甲醛溶液中固定待做免疫组化。

1.5 甲状腺激素水平测定血清T3、T4、TSH采用放射免疫法测定，严格按照放射免疫试剂盒说明书操作。

1.6 乙酰胆碱含量测定采用碱性羟胺比色法测定额叶内乙酰胆碱含量，根据BCA试剂盒操作步骤进行测定。

1.7 免疫组化染色超敏SP法行免疫组化法检测。应用光学显微镜分别拍摄额叶各层：分子层（Ⅰ层）、外颗粒层（Ⅱ层）、外锥体细胞层（Ⅲ层）、内颗粒层（Ⅳ层）、内椎体细胞层（Ⅴ层），随后应用形态学图像分析系统分析Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层munc-18的免疫反应产物的光密度值，取其平均光密度值（average optical density，AOD）。

1.8 统计学处理应用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步分析采用LSD法进行多重比较。

2 结果

2.1 各组大鼠血清甲状腺激素水平与正常对照组相比，甲减组、多奈哌齐治疗组的大鼠血清T3、T4水平均显著减低、TSH水平明显增加，差异有统计学意义（F＝5.14、33.84、24.40，P＜0.01）；甲状腺素治疗组、联合治疗组血清T3、T4、TSH与正常对照组比较差异无统计学意义，见表1。

2.2 各组大鼠额叶中乙酰胆碱含量与正常对照组相比，甲减组大鼠额叶内乙酰胆碱含量明显降低（F＝2.71，P＜0.05），而多奈哌齐治疗组、甲状腺素治疗组、联合治疗组大鼠额叶内乙酰胆碱含量与正常对照组相比，差异无统计学意义；与甲减组额叶内乙酰胆碱含量相比，甲状腺素治疗组差异无统计学意义，而联合治疗组有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3 大鼠额叶各层munc-18表达变化肉眼观察大鼠脑切片，额叶结构清晰，呈棕黄色。光镜下观察正常对照组：munc-18在额叶各层内广泛表达；Ⅰ层水平纤维较多，细胞结构少；Ⅱ层主要见颗粒状排列致密的神经细胞；Ⅲ层可见排列松散大小不等的棕黄色锥体细胞，其中有少量的星形细胞；Ⅳ层可见少量小锥体细胞和大量排列密集的棕黄色星形细胞；Ⅴ层由大量的棕黄色大锥体细胞和少量的小星形细胞组成。各组额叶内munc-18免疫反应的阳性颗粒分布相似，甲减组和多奈哌齐治疗组额叶内锥体细胞的长度增加，树突棘的密度下降，以Ⅲ／Ⅴ层明显；甲状腺素治疗组和联合治疗组锥体细胞恢形态正常，见图1。形态学图像分析系统量化各组大鼠额叶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层内munc-18免疫反应产物的AOD值：甲减组、多奈哌齐治疗组大鼠额叶Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层的AOD值与正常对照组相比均明显降低（F＝3.08、10.45、4.28、7.33，P＜0.05），以Ⅲ／Ⅴ层显著（P＜0.01）；甲状腺素治疗组的munc-18免疫反应产物的AOD值仍然偏低（P＜0.05），联合治疗组的AOD值恢复至正常对照组水平。见图1、表3。

表1 各组大鼠血清T3、T4、TSH水平（n＝8，±s）

与正常对照组比较：**P＜0.01

组别T3（nmol／L）T4（nmol／L）TSH（μmol／L）正常对照0.83±0.1050.10±4.010.96±0.25甲减0.61±0.06**18.20±4.89**21.27±9.90**多奈哌齐治疗0.58±0.05**19.10±3.12**21.02±11.10**甲状腺素治疗0.80±0.2551.28±5.161.33±0.98联合治疗0.82±0.2254.53±6.051.02±0.37

表2 各组大鼠额叶内乙酰胆碱含量（μg／mg，n＝8，±s）

与正常对照组比较：*P＜0.05；与甲减组比较：＃P＜0.05

组别乙酰胆碱正常对照23.43±5.81甲减17.58±2.70*多奈哌齐治疗20.61±3.24甲状腺素治疗20.00±4.24联合治疗23.37±4.49＃

3 讨论

表3 各组大鼠额叶内munc-18表达情况（n＝8，±s）

与正常对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

组别Ⅰ层Ⅱ层Ⅲ层Ⅳ层Ⅴ层正常对照17.49±2.4217.12±2.1112.93±2.659.50±3.6212.12±3.35甲减15.58±3.8412.67±3.77**7.16±4.14**5.13±2.28*5.38±3.54**多奈哌齐治疗15.21±4.0813.87±3.92*8.10±1.07**5.77±1.94*5.27±2.03**甲状腺素治疗17.48±1.9414.55±2.1810.04±1.56*8.80±3.868.01±2.99*联合治疗18.93±1.9416.98±3.3113.75±2.0610.53±3.5910.83±3.99

本研究显示成年期甲减组大鼠额叶内乙酰胆碱含量减少，给予多奈哌齐、甲状腺素或联合治疗后，乙酰胆碱含量均恢复正常，其中甲状腺素联合多奈哌齐治疗有进一步恢复趋势。甲减可以损害额叶中与学习记忆功能密切相关胆碱能系统，本研究也证实了这点，其原因可能与甲减影响胆碱能神经元的数量和形态有关［8］，也可能通过损害syntaxin-1、SNAP-25等突触相关蛋白的表达影响神经递质的释放［3］。另外，有研究［5］证实鼠类大脑中munc-18参与乙酰胆碱的释放，甲减大鼠乙酰胆碱含量减少可能与munc-18表达下降有关。给予多奈哌齐治疗2周后，额叶内乙酰胆碱含量恢复，这与文献［9］报道相符。多奈哌齐联合甲状腺素治疗后，与单独多奈哌齐治疗或甲状腺素治疗相比，额叶内乙酰胆碱含量有进一步恢复趋势。以上结果提示应用多奈哌齐可改善甲减大鼠额叶内乙酰胆碱的含量异常，特别是在甲状腺素替代治疗的基础上。

免疫组化结果显示成年期甲减大鼠额叶munc-18表达减少，其中以Ⅲ／Ⅴ层最为显著。Carageorgiou et al［10］研究显示甲状腺素可以调节脑内蛋白质的合成。munc-18是神经元胞内蛋白，其表达减少可能与血清甲状腺激素水平低下有关。其中，额叶各层的损伤程度表现不一致，Ⅲ／Ⅴ层内甲状腺激素缺乏对munc-18表达的影响最为明显，可能与这两层内绝大部分区域为锥体细胞有关。有文献［11－12］报道甲减损伤海马和额叶内的锥体细胞明显，其所在区域是比较容易损伤、改变的区域。

甲状腺素替代治疗是临床治疗甲减的标准疗法。本研究显示甲减大鼠生理剂量的甲状腺素治疗2周后，额叶内munc-18的表达没有恢复到正常水平。额叶内munc-18表达未完全恢复或许与治疗时间有关。Alzoubi et al［13］发现生理剂量的甲状腺素治疗6周可以逆转海马内的神经颗粒素、钙调蛋白等突触蛋白表达异常，替代治疗时间较短可能是munc-18表达不完全恢复的一个重要因素；额叶内munc-18表达未完全恢复也可能与替代治疗剂量不足有关。既往有文献［14］指出：血清中甲状腺激素浓度远远高于其在中枢神经系统中的浓度，激素替代治疗后，血清甲状腺激素水平可以恢复至一个比较宽的正常范围，这时中枢神经系统中的激素水平可能尚未达到正常。

先前一项尝试给予大剂量甲状腺素治疗至亚甲亢水平的研究［12］，发现甲减大鼠2周激素替代治疗后海马内munc-18表达恢复正常。大剂量甲状腺素治疗有诱导甲亢的风险，本研究在常规甲状腺素治疗基础上加用多奈哌齐，发现甲状腺激素水平正常后额叶munc-18表达也恢复正常。多奈哌齐作为一种乙酰胆碱酯酶抑制剂，近年来动物实验研究［7］表明其有神经保护的作用，联合治疗组中大鼠额叶munc-18恢复正常可能是多奈哌齐神经保护作用的体现。

综上所述，甲减可引起额叶内乙酰胆碱含量改变和munc-18异常表达，单独甲状腺素替代治疗至甲状腺激素水平正常时，上述损害未完全恢复，甲状腺素联合多奈哌齐恢复，提示甲状腺素与多奈哌齐联合治疗可能有利于甲减脑额叶损害恢复。

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Effect of thyroxine and donepezil on acetylcholine content and munc-18 expression in the frontal cortex of rats with adult-onset hypothyroidism

Cai Yaojun，Zha Xiaoxue，Ning Dan，et al
（Dept of Geriatrics Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investgate the thyroxine and donepezil on acetylcholine concentration and munc-18 expression in the frontal lobe of adult-onset hypothyroid rats and clarify the possible molecular mechanism of frontal lobe lesions of hypothyroidism.MethodsThe models of hypothyroidism were established by induction with adding propylthiouracil drinking water for 6 weeks，and since the fifth week，the hypothyroid rats received a two-week treatment of levothyrocine（L-T4），donepezil or a combination of both drugs.The levels of serum triiodothyronine（T3），tetraiodothyronine（T4），thyroid-stimulating hormone（TSH）were measured by radioimmunoassay kits，acetylcholine concentration in frontal lobe was determined by alkaline hydroxylamine colorimetry and the expression and distribution of munc-18 in frontal cortex were evaluated by immunohistochemistry.ResultsIn the hypothyroid rats，the levels of serum T3 and T4 decreased with the increase of TSH（P＜0.01），the content of acetylcholine in frontal lobe was significantly decreased（P＜0.05），and the expression of munc-18 was at significantly lower levels in theⅡ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴlayers of frontal cortex（P＜0.05）.In addition，donepezil treatment reversed the content of acetylcholine to normal values.L-T4 monotherapy normalized the level of serum thyroid hormone and acetylcholine content while the expression of munc-18 was not.Munc-18 was normalized completely by co-administration of L-T4 and donepezil.ConclusionThe alteration of acetylcholine content and expression of munc-18 in the frontal lobe of adult-onset hypothyroidism can be better ameliorated by co-administration of L-T4 and donepezil.

hypothyroidism；frontal cortex；acetylcholine；munc-18；levothyrocine；donepezil

R 581.2；R 322.81；R 446.6-3；R 977.14

1000－1492（2015）01－0025－05

2014－09－18接收

国家自然科学基金（编号：81272152）

1安徽医科大学第一附属医院老年内分泌科，合肥2300222安徽医科大学基础医学院综合实验室，合肥 230032

蔡瑶俊，男，硕士研究生；朱德发，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：zdfa0168＠sina.com