王 芳，金 锐，李 磊，程丰伟，罗 欣，张胜权

基础医学研究

TLR7激动剂Gardiquimod上调BxPC-3细胞中IL-15 mRNA表达

王 芳，金 锐，李 磊，程丰伟，罗 欣，张胜权

目的研究TLR7在胰腺癌BxPC-3细胞中表达，并探讨TLR7激动剂激活TLR7后细胞因子白介素15（IL-15）的表达。方法通过Western blot和Real-time PCR分析TLR7在细胞内的表达水平；BxPC-3细胞经过不同时间点Gardiquimod（3 μg／ml）的处理后，Real-time PCR分析TLR7激活后IL-15 mRNA水平表达变化；Western blot分析Gardiquimod刺激细胞后，磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（PI3K-AKT）信号通路的变化。结果Western blot和Real-time PCR结果显示：与外周血单核细胞（PBMC）相比，TLR7在BxPC-3中弱表达；Real-time PCR分析显示：Gardiquimod处理细胞后能刺激细胞中IL-15的表达；TLR7激动剂能够激活PI3K-AKT信号通路。结论 Gardiquimod激活TLR7后能够上调IL-15的表达，并且其激活与PI3KAKT信号途径相关。

TLR7；Gardiquimod；IL-15；PI3K-AKT；BxPC-3

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一类识别病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）的模式识别受体（pattern-recognition receptor，PRR）［1］。TLRs广泛分布于体内不同免疫细胞表面，如TLR1能在单核细胞、T、B淋巴细胞和NK细胞等多种细胞中表达，TLR3只能够特异性表达于树突状细胞［2］。TLRs的生物学功能主要包括激活固有免疫和参与适应性免疫的应答的启动［3］。同样，TLR7在肿瘤的免疫治疗中也发挥着十分重要的作用［4］。而磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（phosphatidylinositol-3-kinase-protein serine threonine kinase，PI3K-AKT）信号通路与TLRs受体也有密切联系，作为联系细胞外信号分子与细胞内的细胞因子之间的桥梁，在肿瘤细胞的生长、分化、凋亡等方面起着重要的调节作用［5］。Ha et al［6］研究显示，TLR2配体可通过PI3K-AKT信号通路保护心脏进而缓解动脉缺血／再灌注损伤。同时，PI3KAKT在细胞功能调节如防御和免疫方面也发挥重要作用［7］。白介素-15（interleukin-15，IL-15）是一种细胞因子，源于T细胞，能够在体内T、B淋巴细胞、单核巨噬细胞等多种细胞中表达，其生物学功能广泛，能诱导T细胞增殖、NK细胞分化等［8］。Shenoy et al［9］研究显示IL-15能够通过PI3K-AKT和JAK-STAT等信号通路诱导和抑制凋亡，从而对T细胞进行调节。在众多肿瘤中，胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，与其高侵袭性、转移性、耐药性有关［10］。因此，腺癌的治疗目前仍然是医学界的难题。该研究旨在对TLR7与胰腺癌的关系以及TLR7配体Gardiquimod激活TLR7后对信号通路PI3K-AKT和下游细胞因子IL-15表达进行探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂胰腺癌BxPC-3细胞株购自中国科学院上海细胞库，Gardiguimod购自美国Invitrogen公司，RPMI-1640培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司，TLR7、βactin和PI3K-AKT抗体购自美国Cell signaling公司，逆转录试剂和实时荧光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）试剂均购自日本TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 引物登陆NCBI网站检索人GAPDH、IL-15基因序列，Primer Premier 5.0软件设计引物，见表1。

1.3 细胞培养从液氮复苏胰腺癌BxPC-3细胞株，在37℃、5%CO2条件下培养于含10%FBS的1640培养液。细胞长到70%～80%时，以4×104／ml的密度接种于24孔细胞培养板。实验前1 d换无血清培养液，用Gardiquimod（3 μg／ml）在不同时间点（0.2、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0、24.0 h）刺激BxPC-3细胞作为实验组，以不做任何处理的细胞作空白对照组；并另设外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）对照，不做任何处理的细胞作阳性对照组。

1.4 RT-PCR检测IL-15 mRNA的表达水平用TRIzol提取BxPC-3细胞中总RNA，以逆转录试剂盒合成方法合成cDNA。以cDNA为模板，加入特异性引物（表1）配成RT-PCR体系。具体如下：2× SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl、ROX DYEⅡ0.4 μl、上下游引物各0.4 μl、cDNA 2 μl、lddH2O 6.8 μl，总体积20 μl。总体系在AB 7500荧光定量分析仪上按程序运行，以GAPDH为内参。最后用相对定量分析法分析BxPC-3组与PBMC组。

1.5 Western blot分析TLR7的表达及其激活的信号通路经过不同时间点Gardiquimod刺激后，用细胞裂解液裂解细胞提取24孔板中的总蛋白。配制12%SDS-丙烯酰胺凝胶，将蛋白与5×loading buffer混合后上样，浓缩胶中恒压60 V，分离胶加至120 V，待电泳完成，将蛋白转至PVDF膜上（恒流150 mA，3 h）。用5%脱脂牛奶将膜封闭2 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，一抗以工作浓度1∶500，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的二抗（TLR7为兔抗1∶10 000；β-actin为鼠抗1∶12 000；p-AKT为兔抗1∶14 000）。孵育2 h，用ECL发光剂压胶片发光、显影。

1.6 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行分析，数据用±s表示。组间计量资料采用成组设计的方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 TLR7在BxPC-3细胞中表达从BxPC-3及PBMC中提取mRNA和总蛋白，以PBMC作阳性对照组。Western blot和RT-PCR结果显示：与阳性对照组相比，实验组细胞中TLR-7表达，但较弱（F＝2 015）。见图1。

2.2 Gardiquimod刺激BxPC-3细胞能够上调IL-15的表达 IL-15表达具有波动性，IL-15-V1，3的表达呈现升高趋势，在12.0 h时达峰值，约是空白对照组的4倍，之后下降；IL-15-V2也有上升趋势，在3.0 h出现峰值，约是空白对照组的2.3倍。（FIL-15-V1，3＝1 836；FIL-15-V2＝4 580）。见图2。

2.3 Gardiquimod激活BxPC-3细胞中PI3KAKT信号通路与空白对照组相比，加Gardiquimod刺激的细胞中p-AKT在0～3.0 h表达升高，并在3.0 h达到峰值，以后略微下降，呈明显的剂量依赖性（F＝388.745）。见图3。

3 讨论

Gardiquimod是一种咪唑喹啉类小分子化合物，是咪喹莫特的衍生物，作为TLR7的配体，能够激活胞内区Toll／IL-1受体同源区（TIR），通过下游髓样分化因子88（MyD88）信号通路，激活信号蛋白核转录因子κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K等，从而诱导细胞因子IL-6、IL-15等因子，干扰素IFN-γ合成，从而调节免疫反应［11］。

实验表明，TLR7能够在胰腺癌细胞中表达，尽管很弱。进一步的研究［12］显示TLR7的激活诱导下游细胞因子IL-15表达升高。IL-15组织分布极为广泛，在骨骼肌和胎盘中IL-15 mRNA水平很高，也表达于淋巴细胞、单核细胞、NK细胞等表面［13］。IL-15与IL-2氨基酸序列不同，但空间结构相似，因此具有相似的生物学作用。主要有促进T细胞增殖，促进NK细胞胞毒活性产生CK，诱导B细胞增殖产生抗体，激活单核／巨噬细胞等等。故IL-15是参与体内免疫应答的重要细胞因子［9］。本实验中，TLR7激活后能够上调IL-15的表达，进一步诱导体内免疫系统，对胰腺癌的发展起到一定的抑制作用。

程丰伟等［14］研究显示，PI3K-AKT信号通路为细胞内信号传导途径，与肿瘤细胞的增殖与存活、侵袭与转移等行为密切相关。PI3K的异常与类脂磷酸激酶（PTEN）的负调节失活有关，AKT异常会导致下游血管内皮生长因子（VEGF）的高表达，而VEGF是血管生长、肿瘤增殖、迁移的关键。本研究结果显示，PI3K-AKT信号通路被激活并在3.0 h出现了升高的峰值之后略微下降，说明TLR7的激活对胰腺癌的增殖、迁移等具有一定的抑制作用。

［1］ Mai C W，Kang Y B，Pichika M R.Should a Toll-like receptor 4（TLR-4）agonist or antagonist be designed to treat cancer？TLR-4：its expression and effects in the ten most common cancers［J］. Onco Targets Ther，2013，6：1573－87.

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The agonist of TLR7 Gardiquimod up-regulates the expression of interleukin-15 in BxPC-3 cells

Wang Fang，Jin Rui，Li Lei，et al
（Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the expression of Toll-like receptor 7（TLR7）in pancreatic cancer BxPC-3 cells，and to explore the effect of TLR7 activation on the expression of interleukin-15（IL-15）.MethodsBxPC-3 cells were used to analyze the expression of TLR7 by Western blot and Real-time PCR.The cells were treated with Gardiquimod（3 μg／ml）at different times，the expression of IL-15 at mRNA level by Real-time PCR.Western blot was performed to analyze the phosphorylation level changes of phosphatidyl inositol kinase serine／threonine kinase （PI3K-AKT）protein in BxPC-3 cells stimulated by TLR7 ligand Gardiquimod.ResultsWestern blot and Realtime PCR results showed that compared with peripheral blood mononuclear cells （PBMC），TLR7 presented weak expression in BxPC-3 cells.Gardiquimod could increase the expression of IL-15 in BxPC-3 cells.TLR7 agonist could activate the PI3K-AKT signaling pathway.ConclusionGardiquimod can up-regulate the expression of IL-15 and this effect can be associated with PI3K-AKT signaling pathway.

TLR7；Gardiquimod；interleukin-15 ；PI3K-AKT；BxPC-3

R 34

A

1000－1492（2015）01－0001－04

2014－09－24接收

国家自然科学基金（编号：81271748）

安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室，合肥230032

王 芳，女，硕士研究生；张胜权，男，博士，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：sqz36＠yahoo.com