涂红艳，肖 望 ，谢 君，魏燕霞

(广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东高校应用生态工程技术开发中心，广州510303)

所罗门姜黄(Curcuma soloensis Valeton)是姜科(Zingiberaceae)姜黄属(Curcuma)多年生根状茎草本花卉植物，其穗状花序从根状茎抽出，呈圆宝塔状，花色高雅脱俗，花期长达半年. 所罗门姜黄是切花的优雅花材，瓶插寿命可达15 ～20 d，极具观赏价值和经济价值［1－2］.

所罗门姜黄通常采用传统的分切根状茎繁殖，受季节限制，且繁殖系数低，每年只可获得2 ～3 倍的增殖率，加之栽培过程易受病害影响，很难满足其市场开发的需求，故难以在花卉市场占据一席之地［1］.组织培养技术是大量快速繁殖所罗门姜黄的有效途径.目前所罗门姜黄离体植株再生体系的建立主要是通过以芽繁芽方式直接再生植株［3］和通过愈伤组织间接再生植株［2］2 种途径. 利用薄层细胞培养技术建立所罗门姜黄的离体植株再生体系目前尚未见报道.

薄层细胞培养(thin cell layer，TCL)，最初是指从外植体表皮部位撕下一块厚3 ～6 层细胞(包括表皮、亚表皮及皮层细胞)的薄片置于适宜培养基上进行的固体或液体培养，现在也将外植体横切成大约0.3 ～1.0 mm 厚的薄片(micro-cross section)进行培养，统称为薄层细胞培养［4－5］. 薄层细胞培养是研究植物形态发生的一个较理想的实验体系. 由于薄层细胞培养的外植体体积小、细胞数目少、内源生长物质和营养物质含量较少，所以对外界因子的调节较为敏感.它在激素组成与用量方面比常规用器官为外植体进行的组织培养少，但芽再生率较高，再生周期短［5－8］.薄层细胞培养还可应用到植物基因工程和作物改良中，由于薄层的横切面伤口较大，可作为优良的转化受体，增加转化几率，且薄层仅仅由几层细胞组成，易于筛选，减少了嵌合体的出现频率［9－10］.利用此技术已在油菜(Brassica napus)、烟草(Nicotiana plumbaginifolia)、马唐(Digitaria sanguinalis)、菊花(Dendranthema ×grandiflora)［11］等植物中成功获得了转基因植株. 本研究以所罗门姜黄试管苗茎基部为外植体，将它们的横切薄层放在添加不同外源激素的培养基上诱导不定芽的再生，同时还研究了培养基组成对不定芽成苗生长的影响，旨在建立高效、稳定的所罗门姜黄薄层再生体系，为通过生物技术进行植物品种改良提供良好的植株再生体系.

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料所罗门姜黄(Curcuma soloensis Valeton)于2012年3月采集于广州市农业技术推广中心种植基地，选取1 ～3 cm 长的根状茎腋芽作为外植体.

1.2 方法

1.2.1 不定芽的诱导与试管苗的获得 选择生长状况良好的根状茎腋芽，用水冲洗干净后用洗洁精浸泡30 min，再用流水冲洗30 min，用75%乙醇溶液进行表面消毒30 s，再经1 g/L HgCl2溶液消毒15 ～20 min，无菌水冲洗5 ～6 次. 切取长0.5 ～2.0 cm 的芽作为外植体，将外植体接种于芽诱导培养基［12］Ms+3 mg/L 6－BA +0.2 mg/L NAA 中，诱导出不定芽.将诱导出的1 ～2 cm 不定芽转入成苗培养基1/2 Ms+1 g/L 活性炭中进行培养，得到健壮的试管苗.

1.2.2 不定芽的诱导 取健壮试管苗(图1A)，从上到下依次切取厚约0.5 ～0.8 mm 的薄层，将茎基部第1 条生根部位标示为1，向上、向下分别标号为2、3、4;－1、－2、－3、－4(图1B)等.将切取的薄层放入含有不同浓度的激素的培养基中(表1)，在光照或黑暗条件下诱导不定芽的发生，研究试管苗茎基部不同部位薄层的出芽数，以及6－BA、TDZ 和光照条件对薄层出芽的影响，30 d 后统计出芽数.

图1 所罗门姜黄试管苗茎基部薄层切取位置示意图Figure 1 Thin cell layers cut from stem base of regenerated plantlets of Curcuma soloensisValeton

1.2.3 成苗培养 将从薄层诱导出的不定芽分别接种于1/2 Ms、1/2 Ms +1 g/L 活性炭2 种成苗培养基中，研究培养基的组成对不定芽成苗的影响，30 d 后统计植株的根数、根长、叶片数和叶片间距等指标.

1.2.4 培养条件 培养室温度控制在25 ±2 ℃，光照强度30 μmol/(m2·s)，光照时间16 h 光/8 h 暗.

1.2.5 炼苗移栽和驯化 从培养瓶中取出试管苗，用自来水冲洗干净根部残留的培养基，栽植于自封袋(15 cm×20 cm)内富含有机质的土壤(于花卉市场购买的营养土、培养土等)中，土壤用量为30 ～50 mL，每袋种植植株1 ～2 棵，用浓度为1/20 Ms 培养基的无机盐溶液一次浇透，整个过程不再需要施肥.在自封袋内培植30 ～60 d 后，移栽到花盆里，置于荫棚内培养，得到所罗门姜黄的花卉苗.

1.2.6 数据统计 所有实验结果重复3 次，所得数据采用均数±标准差表示. 采用邓肯多重分析法进行显著性差异分析，最小显著性差异在5%水平上显示.

2 结果与讨论

2.1 不同切片部位对薄层切片出芽的影响

以所罗门姜黄试管苗(图1A)茎基部第1 条生根部位为基础切取含有生长点细胞的薄层(图1B)，向上向下可再切取3 ～4 片薄层，平均每个外植体可切6 ～8 片薄层.苗越壮，切取的薄层数越多，最多一棵苗可切到10 片.培养1 周后，大部分薄层都可以出芽，其中在第1 条生根部位切取的薄层(图1B 中的标号1)出芽能力最强，达到2.75个，紧接其下的薄层部位(图1B 中的标号－1)和其上的薄层部位(图1B 中的标号2)出芽能力次之，分别为1.95 和1.75个(图2).

薄层培养3 ～4 d 开始出现芽点，7 d 长出2 ～3 cm 的小芽，14 d 芽开始抽出叶，21 d 芽长出少量根，30 d 时统计，每片薄层一般可出1 ～3个芽(图3 B)，最高可出8个芽(图3C). 随着培养时间的延长，不断长出新芽.培养45 d 后从一棵试管苗所切薄层中最高可获得15个不定芽，增殖倍数高达15倍.薄层出芽率受苗的健壮度的影响较大，以健壮的苗切的薄层出芽多.

图2 所罗门姜黄薄层不同部位的出芽数Figure 2 Frequency of adventitous shoot formation at different positions from thin cell layer culture of Curcuma soloensis Valeton

2.2 不同激素组合和光照条件对所罗门姜黄薄层出芽的影响

与只添加生长素NAA 相比，在培养基中添加细胞分裂素6－BA 或TDZ 能显著促进薄层不定芽的产生. 随着6－BA 或TDZ 质量浓度增大，薄层出芽数增加. 薄层在光照培养30 d，6－BA 质量浓度为3 mg/L 或TDZ 质量浓度为0.1 mg/L 时，出芽数最高，分别达到9.3 或10个(表1). 在黑暗培养15 d，转入光照培养15 d 后，薄层的出芽数明显增加，最高可获得12.2个芽，比在光照培养30 d 的薄层出芽数增加了31.2%. 当培养基只有生长素类物质时，薄层出芽数较低. 薄层出芽的最适培养基为MS+3 mg/L 6－BA +0.2 mg/L NAA，培养条件为15 d 黑暗培养加上15 d 光照培养.

表1 激素组合和培养条件对所罗门姜黄薄层外植体出芽数的影响Table 1 Effects of hormone combinations and culture condition on number of adventitous shoots formation from thin cell layer culture of Curcuma soloensis Valeton

2.3 不同培养基对不定芽成苗生长的影响

从薄层诱导出的不定芽分别接种到不同的成苗培养基中.发现不同培养基中的再生植株在根长、叶片数和叶间距上表现出显著的差异(表2). 培养基中添加1 g/L 活性炭后，根的数量变化不大，但总根长增加，次级须根增多，叶片数增加，叶间距明显缩短，叶片颜色深绿，株型紧凑，苗生长健壮，与活性炭减弱光照保护IAA，间接促进根生长，从而促进茎、叶生长有关［13－14］.

表2 不同培养基对所罗门姜黄不定芽成苗的影响Table 2 Effects of medium components on shoot regeneration of Curcuma soloensis Valeton

2.4 试管苗的室外驯化生长

取成苗培养基中获得的试管苗(图3A)，从其茎基部继续切取含有生长点细胞的薄层进行不定芽的再生培养.经过15 代的继代培养(图3E)，薄片不定芽增殖倍数保持稳定，未出现再生频率下降的现象，即在1个继代周期内，1 棵试管苗最多可获得15个不定芽，增殖倍数高达15 倍. 而吴国江等［1］采用以芽繁芽的方式进行所罗门姜黄的快繁，在1个继代周期中，1个芽可形成5 ～10个再生芽，增殖倍数为5 ～10 倍.

将试管苗移栽到自封袋后都能成活(图3F).在自封袋培植30 ～60 d 后，移栽到花盆，生长状况良好，成活率高达95%以上(图3G).试管苗移栽到花盆后，最快的生长3.5个月即现花蕾，开花正常，每棵植株当年至少可抽1 ～2 枝花序，部分多达3 枝(图3H).从不同成苗培养基中获得的试管苗室外开花期较相近，为47 d 左右. 花期可持续5个月以上，花朵开放可持续到当年的12月中旬. 当气温下降到7 ～19 ℃时，植株会很快枯萎.试管苗室外种植2年多来，未发现变异苗.

薄层细胞培养用于通过生物技术进行植物品种改良的研究.本研究团队采用薄层细胞培养技术对白姜花(Hedychium coronarium)的薄层进行体外诱变处理，成功获得了白姜花四倍体植株［15］，经过近3年的栽培，植株的各种性状保持稳定遗传，为所罗门姜黄进行品种改良奠定了良好的基础.

图3 利用薄层细胞培养技术建立所罗门姜黄植株再生体系Figure 3 Plant regeneration system from thin cell layer culture in Curcuma soloensis Valeton

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