李娜娜，黄嘉荣，詹求强

(华南师范大学华南先进光电子研究院，广州510006)

纳米金表面等离子体因其独特的光学、化学性质和良好的生物相容性，近年来被广泛用于光学探针、电化学传感和生物传感等领域［1－2］. 纳米金具有明显的表面等离子体共振吸收峰，其波长与纳米金的粒径、周围的介质、粒子的间距等密切相关，导致纳米金溶胶颜色差异较大［3］. 纳米金比色法则通过纳米金溶液颜色的变化检测微量样品. 在纳米金比色法中，微量的待测样品可改变纳米金颗粒的聚集情况，从而导致溶液产生颜色变化，用肉眼即可分辨.

结合抗体或其他靶向试剂(如蛋白质、多肽和核酸)，纳米金比色法被广泛用于金属离子［4－5］、DNA［6－7］、生物酶［8－9］等目标分子的微量检测和分析. 与传统荧光分子相比，纳米金具有很高的消光系数，其检测灵敏度可达到荧光分子的103～104倍［10－11］. 纳米金比色法以其简单快速、灵敏度高、肉眼可分辨且不需要借助复杂仪器等卓越优势，在生化检测、环境检测等领域具有广阔的应用前景［12－13］.

过氧化氢(H2O2)在生化领域应用广泛，尤其常用于传统的酶联免疫吸附检测技术中. 利用纳米金比色法设计检测微量H2O2的方法，可得到较高的检测灵敏度［14］. 结合酶联免疫吸附技术，该方法可直观快速、灵敏地检测多种微量目标物质. 将传统酶联免疫吸附技术和纳米金测定H2O2的方法相结合，已经成为一种新型的检测艾滋病病毒技术［15］，检测灵敏度可达到10－18g/mL，比目前检测技术高10 倍以上.该技术用过氧化氢酶标记HIV-1 衣壳抗原p24，浓度极低的p24 即可引起H2O2浓度的减小和纳米金颗粒的不规则聚集，进而使溶液颜色呈现蓝色;阴性结果则是纳米金粒子仍保持为单分散形态，溶液颜色显示为红色，用肉眼就可以分辨出以上的颜色变化. 运用这个技术，在釆用常规核酸检测方法都无法检出的情况下，研究人员可以在HIV 患者血液中检测出超低浓度的p24. 但该技术具有一定的局限性:(1)反应体系稳定性较差，其结果随反应时间的变化较快，为检验带来不便;(2)只能定性分析所测样品浓度在检测极限范围内外，却无法精确定量. 本文在此基础上，应用纳米金表面等离子体建立微量H2O2的检测体系，提高反应体系的稳定性并探索精确定量方法，并降低检测的分辨极限，为微量样品检测提供更好的平台.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

紫外－可见－近红外分光光度计(PerkinElmer，Lambda 950);酶标仪(Bio-Rad，iMark);电子透射显微镜;磁力搅拌器;pH 计;2-吗啉乙磺酸(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司);氢氧化钠(国药试剂，分析纯);过氧化氢(阿拉丁试剂有限公司，分析纯);氯金酸(阿拉丁试剂有限公司，Au≥48%).

1.2 实验方法

取1.95 g 2-吗啉乙磺酸粉末溶于80 mL 去离子水中，在磁力搅拌下用1 mol/L 过氧化氢溶液调节pH 6.5，转移至100 mL 容量瓶定容，为100 mmol/L 2-吗啉乙磺酸储备液，室温储存备用. 另外，将1 g氯金酸粉末溶于25.4 mL 去离子水中，为100 mmol/L 氯金酸储备液，避光存于4 ℃中，保存时间勿超过15 d. 称取0.012 3 g 还原型半胱甘肽粉末溶于100 mL 去离子水中，配制成400 μmol/L 半胱甘肽溶液，4 ℃保存.

使用1 mmol/L 的2-吗啉乙磺酸溶液配置浓度为20 ～200 μmol/L 的H2O2溶液以及0.2 mmol/L 氯金酸溶液，现配现用.于96 孔板中，每孔各加100 μL氯金酸溶液和100 μL H2O2溶液，静置反应10 min.向各反应孔加入10 μL 半胱甘肽溶液，并于紫外－可见－近红外分光光度计或者酶标仪下读取吸光度.反应系统稳定情况检测部分未加半胱甘肽溶液.

2 结果与讨论

2.1 裸眼检测体系的辨色极限及金颗粒电镜图

2-吗啉乙磺酸可作为一种弱还原剂，与氯金酸溶液反应将生成团聚态的纳米金颗粒，反应溶液呈现裸眼可辨的蓝色. 此时，如果加入过量的H2O2作为辅助还原剂，将促进反应生成分散态的纳米金颗粒，使反应溶液呈现红色. 因此，纳米金表面等离子体可作为检测微量H2O2的灵敏探针.

实验分别检测0、20、40、60、80、100、120、140、160、180 及200 μmol/L 的H2O2溶液，反应10 min后辨色(图1). 当H2O2的浓度c ＜100 μmol/L 时，反应溶液肉眼观察显示蓝色;当c ＞120 μmol/L 时，反应溶液呈现红色. 该检测体系裸眼检测H2O2极限可分辨浓度差为20 μmol/L.

其中，取加入了60 μmol/L 和160 μmol/L H2O2的反应孔产物分别作为蓝色和红色反应孔的代表，制备铜网样品，用电子透射电镜观察结果(图2).蓝色反应孔的反应产物为团聚态的的纳米金颗粒，红色反应孔的反应产物为分散态的纳米金颗粒，与实验原理相符.

图1 不同H2O2 浓度反应孔的辨色图Figure 1 Photograph of nanoparticle solutions for different H2O2 concentrations

图2 不同颜色反应孔产物电镜图Figure 2 TEM images of nanoparticles in solutions of different colors

2.2 反应体系稳定性分析及其终止

2.2.1 反应体系的稳定性分析 实验发现，反应体系在3 h 内稳定性差，且在反应进行45 min 内颜色变化较快，对下一步检测和定量分析带来困难. 随着反应时间增加，c ＞120 μmol/L 的反应孔所生成的分散态纳米金颗粒将逐渐增加，红色逐渐加深;c＜100 μmol/L 的反应孔也将生成分散态的纳米金颗粒，逐渐呈现红色，具体辨色结果见图3A. 反应进行15 min 后，c 为100 μmol/L 和80 μmol/L 的反应孔开始略微变红;反应进行20 min 后，此2 孔与更低过氧化氢浓度的反应孔颜色有明显区别，呈现红色，并逐渐加深(图3A). 此外，c ＜60 μmol/L 的反应孔所呈现的蓝颜色也随着反应时间不断加深.其中，c=60 μmol/L 的反应孔在反应进行45 min 后也已变为红色.

由于纳米金溶液在波长为570 nm 处有特征吸收，实验也通过检测溶液在570 nm 处的吸光度(OD570)来监测纳米金生成的稳定情况. 图3B 为不同反应时间各反应孔的吸光度OD570变化曲线. c＞180 μmol/L 的反应孔在反应10 min 后OD570保持不变，反应稳定;而c ＜160 μmol/L 时，反应孔的OD570则在反应45 min 内变化较快，之后达到稳定.此外，随着反应孔中所加入H2O2浓度的降低，反应体系的OD570需要的稳定时间明显增加，与辨色结果中较低H2O2浓度反应孔逐渐变红的现象相吻合.

图3 不同反应时间下不同浓度H2O2 的稳定情况Figure 3 Detection stability of different reaction time for different hydrogen peroxide concentrations

2.2.2 半胱甘肽对反应体系的终止效果 为了方便下一步的检测和量化分析，实验使用还原型半胱甘肽作为反应体系的终止剂，以提高反应体系的稳定性. 由于还原型半胱甘肽对纳米金颗粒表面具有较好的亲和性，反应体系中的半胱甘肽将附着于纳米金表面，从而阻止了金颗粒的进一步团聚，终止反应. 反应进行10 min 后，向各反应孔中加入10 μL的半胱甘肽溶液，所得不同反应时间各反应孔情况见图4A. 加入半胱甘肽后，各反应孔的辨色结果不再随时间改变，c ＜100 μmol/L 的反应孔保持蓝色，c ＞120 μmol/L 的反应孔保持红色. 不同反应时间各反应孔的吸光度OD570变化曲线见图4B. 加入半胱甘肽后，各反应孔在反应15 min 后的OD570基本不变，反应稳定，与辨色结果中各反应孔颜色稳定的现象相吻合. 实验表明，还原型半胱甘肽溶液可有效终止各孔的反应，使纳米金颗粒的状态稳定.

图4 加入半胱甘肽后不同反应时间下H2O2 的稳定情况Figure 4 Detection stability of different reaction time with L-glutathione for different hydrogen peroxide concentrations

2.3 检测结果吸收光谱及定量分析

为了精确定量H2O2浓度，实验使用紫外－可见－近红外分光光度计测定不同H2O2浓度反应孔生成物的吸收光谱(图5A). c ＜100 μmol/L 的反应孔产物在波长约550 nm 处有吸收峰，且吸收强度与c 成正相关. 而c ＞120 μmol/L 的反应孔产物吸收峰逐渐往短波长方向偏移，最终峰值约为540 nm.实验对各反应孔产物在630 nm 和545 nm 处吸光度的比值(OD630/545)进行分析，得到不同浓度H2O2的定量分析曲线(图5B). 各反应孔产物的OD630/545与c(μmol/L)呈良好的线性关系，其回归方程为OD630/545=－0.003 02c+1.011 77.

图5 不同浓度过氧化氢反应孔的吸收光谱及定量分析Figure 5 Ultraviolet-visible spectra and linear relativity of regressive curves of OD630/545 for different H2O2 concentrations

2.4 裸眼分辨极限下的检测分析

根据定量分析曲线，可有效地对裸眼分辨极限下的检测样品进行定量分析. 实验设计了加入100、102、104、106、108、110、112、114、116、118 和120 μmol/L 过氧化氢的反应孔，辨色结果见图6. c =100 μmol/L 的反应孔呈现蓝色，c =120 μmol/L 的反应孔呈现红色，而中间浓度的反应孔呈现从蓝色过渡到红色的辨色结果，裸眼难以区分. 实验中各反应孔的吸光度OD630/545如图7 所示，OD630/545与过氧化氢浓度c(μmol/L)呈良好的线性关系. 应用OD630/545可精确定量H2O2浓度，降低裸眼检测途径下该方法的分辨极限.

图6 不同浓度过氧化氢反应孔的辨色图(100 ～120 μmol/L)Figure 6 Photograph of nanoparticle solutions for different H2O2 concentrations (100 ～120 μmol/L)

图7 裸眼分辨极限下不同浓度过氧化氢反应孔吸光度OD630/545(100 ～120 μmol/L)Figure 7 OD630/545 for different H2O2 concentrations (100 ～120 μmol/L)beyond the limit of detecting resolution with naked eyes

3 结论

本实验在酸性2-吗啉乙磺酸介质中，建立基于纳米金表面等离子体的微量过氧化氢的检测体系，其裸眼检测H2O2极限可分辨浓度差为20 μmol/L.实验使用半胱甘肽有效终止反应，提高了体系的稳定性，并利用光谱分析精确定量H2O2浓度，降低裸眼检测途径下该方法的分辨极限. 该检测方法操作简单、灵敏度高，便于结合传统酶联免疫吸附技术，在微量生物分子检测领域有广阔应用前景.

［1］Saha K，Agasti S S，Kim C，et al. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing［J］. Chemical Reviews，2012，112(5):2739－2779.

［2］孙双姣，蒋治良. 金纳米微粒的制备和表征及其在生化分析中的应用［J］. 贵金属，2005，26(3):55－65.Sun S J，Jiang Z L. Preparation and characterization of gold nanoparticles and their application in biochemical analysis［J］. Precious Metals，2005，26(3):55－65.

［3］刘刚，潘敦，刘丽，等. 纳米金与生物分子的相互作用及生物传感检测［J］. 纳米科技，2009，6(3):6－9.Liu G，Pan D，Liu L，et al. Interaction of gold nano particles and biomolecules and their application in biosensor［J］. Nanomaterial ＆ Application，2009，6(3):6－9.

［4］Wang L，Liu X，Hu X，et al. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers［J］. Chemical Communications，2006，28(36):3780－3782.

［5］Wang H，Wang Y，Jin J，et al. Gold nanoparticle-based colorimetric and“Turn-On”fluorescent probe for mercury(II)ions in aqueous solution［J］. Analytical Chemistry，2008，80(23):9021－9028.

［6］Cordray M S，Amdahl M，Richards-Kortum R R. Gold nanoparticle aggregation for quantification of oligonucleotides:Optimization and increased dynamic range［J］. Analytical Biochemistry，2012，431(2):99－105.

［7］Xu W，Xue X，Li T，et al. Ultrasensitive and selective colorimetric DNA detection by nicking endonuclease assisted nanoparticle amplification［J］. Angewandte Chemie International Edition，2009，48(37):6849－6852.

［8］Jv Y，Li B，Cao R. Positively-charged gold nanoparticles as peroxidiase mimic and their application in hydrogen peroxide and glucose detection［J］. Chemical Communications，2010，46(42):8017－8019.

［9］Kim J W，Kim J H，Chung S J，et al. An operationally simple colorimetric assay of hyaluronidase activity using cationic gold nanoparticles［J］. Analyst，2009，134(7):1291－1293.

［10］Gribnau T C J，Leuvering J H W，van Hell H. Particlelabelled immunoassays:A review［J］. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications，1986，376:175－189.

［11］Storhoff J J，Lucas A D，Garimella V，et al. Homogeneous detection of unamplified genomic DNA sequences based on colorimetric scatter of gold nanoparticle probes［J］. Nature Biotechnology，2004，22(7):883－887.

［12］Xia F，Zuo X，Yang R，et al. Colorimetric detection of DNA，small molecules，proteins，and ions using unmodified gold nanoparticles and conjugated polyelectrolytes［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107(24):10837－10841.

［13］马立娜，刘殿骏，王振新. 金纳米粒子探针的合成及应用［J］. 分析化学，2010，38(1):1－7.Ma L，Liu D，Wang Z. Synthesis and applications of gold nanoparticle probes［J］. Chinese Journal of Analytical Chemistry，2010，38(1):1－7.

［14］Sang Y，Zhang L，Li Y F，et al. A visual detection of hydrogen peroxide on the basis of Fenton reaction with gold nanoparticles［J］. Analytica Chimica Acta，2010，659(1/2):224－228.

［15］de la Rica R，Stevens M M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye［J］. Nature Nanotechnology，2012，7(12):821－824.