聂松柳，沈炳香，段自皞，蒋俊杰，王法财

(安徽医科大学附属六安医院药学部，安徽六安 237005)

大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)是临床治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)和骨肉瘤患者的重要化疗方案。然而，MTX体内代谢过程、血药浓度个体差异大，在抑制肿瘤细胞发挥疗效的同时也增加了对机体正常细胞的毒性，可产生严重甚至致命的毒副作用，如肾衰、肝损害、骨髓抑制、胃肠道反应、皮肤黏膜反应以及因此而引起的继发感染、出血等［1］。

MTX血药浓度监测能满足化疗方案的个体化，增加疗效，有效减少MTX的毒副作用，已为临床所公认。

本研究使用Spearman相关分析法分析了MTX 20 h和44 h血药浓度与MTX实验室肝肾功能指标之间的联系，探讨了监测MTX 20 h、MTX 44 h的血药浓度在预防甲氨蝶呤毒性中的作用。

1 仪器及试药

1.1 仪器 美国Waters公司高效液相色谱仪，梅特勒-托利多AL104、ABS135-S电子天平，梅特勒-托利多pH酸度计，飞鸽牌GL-16G-2超低温高速离心机，飞鸽牌TDL80-2B普通离心机，减压干燥箱，水浴锅，微型漩涡混合仪。

1.2 试药 对照品:MTX(批号:100138-200603)由中国药品生物制品检定所提供。甲醇为色谱纯(美国TEDIA公司)，水为自制双蒸水，其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1 对象 2009年11月—2014年6月入住我院成人ALL患者，接受大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)化疗+亚叶酸钙(CF)解救方案进行治疗。记录患者化疗前后血常规、肝肾功能、血糖、血脂、乳酸脱氢酶(LDH)等相关实验室检验指标。

2.2 用药方案及样本采集 MTX剂量为3～6 g·m-2，起始0.5 g在30 min内快速静脉滴注，剩余量在剩下的23.5 h内静脉维持输注。用药当天给予5%碳酸氢钠静滴，使尿液pH＞7;在化疗当天及后3 d内给予大量水化;MTX应用结束后24 h应用CF分次解救，每6 h一次，共8次，首剂加倍，解救至MTX血药浓度＜0.1μmol·L-1。血液样本分别于MTX静滴结束后0、20、44 h采集，取静脉血2 mL。

2.3 血液样本处理 血液样本3 000 r·min-1离心，分离血清。取血清200μL，加15%高氯酸30 μL，漩涡混合 1 min，15 000 r·min-1离心 10 min，吸取上清液180μL置一干净离心管中，加入4 mol·L-1NaOH 10 μL，漩涡混合30 s，取25 μL进样。

2.4 色谱条件 色谱柱:Waters symmetry柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，C18)，保护柱:Waters保护柱(20 mm ×3.9 mm，5 μm，C18);流动相:磷酸盐缓冲液(pH6.8)∶甲醇 =80∶20(V/V);流速:1.0 mL·min-1;柱温:35℃;紫外检测波长:306 nm。杭州英谱HS色谱数据工作站 V4.0+。血清中杂质对MTX检测无干扰，MTX基线分离，MTX保留时间为13.1 min，色谱分析在20 min内完成。

2.5 血清标准曲线及线性关系 MTX:精密称取MTX对照品适量，用磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶解配制为200μmol·L-1原液，以MTX原液和空白血清配制浓度为 0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol·L-1标准血清样品。采用“2.2”项下方法处理进样，检测结果根据峰高(Y)和浓度(X)进行线性回归。因MTX浓度跨度大，为减少误差，分两段处理。结果，分别得回归方程:Y1=1 520.6X-34.199(r=0.999 4，n=6)和 Y2=1 517.5X-948.98(r=0.999 5，n=6)。表明本方法的甲氨蝶呤检测浓度分别在 0.05 ～2.5 μmol·L-1、2.5 ～100μmol·L-1范围内线性关系良好。

2.6 精密度测定结果 取标准液一定量同上述操作，配成 1、10、100 μmol·L-13 种浓度，每种浓度平行做3份，按前述方法提取进样，连续测定3 d，计算日内、日间精密度，结果日内、日间RSD分别为(4.0 ±1.31)%、(4.9 ±1.13)%，说明测定方法能满足血药浓度分析的要求。

2.7 提取回收率试验 取1、10、100μmol·L-13种浓度的标准液，按“2.3”项下方法操作，测定得MTX峰高H1，同时配制与各浓度质控样品相同标示量的水溶液直接进样，测定MTX峰高H2，计算各浓度样品提取回收率(提取回收率 =H1/H2×100%)，结果见表1。

表1 绝对回收率及方法回收率(n=6)

2.8 稳定性试验 取1μmol·L-1的MTX标准血样1 mL，置-20℃冻存，连续冻融3次，分别于冻存前及每次冻融后测定MTX浓度，考察冻融稳定性。结果，3次反复冻融后测定的浓度为冻融前测定浓度的(100.2±5.78)%，表明反复冻融后的样品表现较稳定。另取按“2.3”项下方法处理后的待测样品，置室温条件下考察放置稳定性。结果浓度为1 μmol·L-1的 MTX 标准血样在处理后 0、8、24 h 三个时间点测得的浓度分别为 0.996、1.003、0.998 μmol·L-1，平均(0.999 ±0.02)μmol·L-1，RSD=3.45%，说明处理后的待测样品室温放置24 h内也较稳定。

2.9 实验室质控方法 本实验室MTX血药浓度监测的方法学3个月更新一次，每次均重复本文2.5至2.8中标准曲线的制作、精密度、回收率、稳定性实验，确保标准曲线的线性关系良好。另外，在监测患者的血药浓度的过程中，我们都会测定一个已知浓度的MTX血样作为质控，以确保患者血药浓度监测的数据准确。2.5至2.8中方法学相关数据为2014年8月份最近一次的结果。

2.10 数据分析及统计学处理 所有患者按用药结束后20、44 h的MTX血药浓度与肝肾功能各项指标进行相关分析。统计学方法应用SPSS 19.0软件。计量资料以±s表示。采用Spearman相关分析两变量间相关性。

3 结果

3.1 22例次血药资料 选22例次资料齐全的ALL患者采用HD-MTX+CF方案化疗后MTX血药浓度监测的结果:用药结束后0 h的MTX有效浓度为(52.99 ±22.59)μmol·L-1，20 h 及44 h 的血药浓度分别为(3.42 ± 7.64)μmol·L-1、(0.53 ±0.99)μmol·L-1。

3.2 MTX 20 h、44 h血药浓度与肾损害的关系22例ALL患者中有9例次在20 h出现MTX体内蓄积，有10例次在44 h出现MTX体内蓄积。

Spearman相关分析显示:化疗后20 h血MTX浓度与患者化疗后肌酐(CRE)值呈正相关(r=0.657，P ＜0.01)，而与尿素氮(BUN)值、尿酸(UA)值无关，见图1。

化疗后44 h血MTX浓度也与患者化疗后CRE呈正相关(r=0.749，P ＜0.01)，而与 BUN 值、UA值无关，如图2。

3.3 MTX 20 h、44 h血药浓度与肝功能指标的关系22例ALL患者化疗后有5例次出现总胆红素(STB)偏高的现象，12例次直接胆红素(DBIL)明显升高，2例次谷草转氨酶(AST)偏高，4例次谷丙转氨酶(ALT)偏高。

Spearman相关分析显示:化疗后20 h血MTX浓度与患者化疗后 DBIL值呈正相关(r=0.562，P＜0.01)，与 STB 呈正相关(r=0.533，P ＜0.01)，与ALT值也呈正相关(r=0.450，P ＜0.05)，与 AST 呈正相关(r=0.439，P ＜0.05)，见图3 ～6。

而化疗后44h血MTX浓度与患者化疗后STB、DBIL、ALT、AST 值均无关。

4 讨论

MTX的细胞毒作用是非选择性的，在抑制肿瘤细胞的同时也增加了对机体正常细胞的毒性。为减少MTX的毒副作用，需要使用CF解救，而CF解救MTX引起的不良反应同时，也一定程度抵消了MTX的抗白血病作用。因此根据MTX的血药浓度适度适量的CF解救至关重要［2-3］。

本研究的结果显示MTX 20、44 h血药浓度与患者化疗后血CRE值呈正相关。这说明，对于ALL患者肾功能损害，MTX 20、44 h血药浓度均有明显的预测作用。另有虞国慧等的研究［4］称44 h血药浓度与化疗前血CRE值呈正相关。Holmboe等的研究［5］称MTX主要由肝脏代谢为7-OH-MTX，由肾脏主要以原型清除，MTX的排泄延迟会加重肾功能受损。我们可以推论，肾功能不全和MTX的排泄延迟是互为因果的，化疗前肾功能不全会引起MTX的排泄延迟，而MTX排泄延迟会进一步引起肾功能损害。因此，肾功能不全的患者使用MTX化疗时应慎重。如果患者出现MTX排泄延迟会应及时水化、碱化尿液、增加CF解救剂量，以缓解MTX的细胞毒性，同时检查肝肾功能指标，严重时考虑血液透析，降低血液MTX水平。给予carboxypeptidase 2(CPDG2，羧肽酶)已得到证实可在15 min内有效降低MTX水平(95.6% ～99.6%)。CPDG2通过水解MTX为无活性的代谢产物(DAMPA和谷氨酸)，而发挥作用。因此，如果能在早期给予CPDG2，可能不再需要透析治疗［6-7］。但目前，CPDG2的使用仍属研究阶段，未在临床广泛使用。

本研究的结果还显示MTX 20 h血药浓度与患者化疗后血 STB、DBIL、ALT、AST 值均呈正相关，而44 h血 MTX 浓度与 STB、DBIL、ALT、AST 值无相关性。这说明，对于应用HD-MTX化疗的ALL患者造成肝损害，MTX 20 h血药浓度监测具有预测作用。MTX造成的肝脏损害可能是急性的、可恢复的，MTX在化疗20 h时对患者造成的肝损害到第3天44 h时，随MTX的消除肝功能得到了恢复。

MTX造成不良反应的作用机理尚不完全明确。国外研究表明，HD-MTX给药后引起的急性肝脏毒性与MTX在机体内的主要代谢产物7-OH-MTX浓度有关［5］。另有研究表明，MTX治疗ALL的疗效和毒副作用可能与胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)基因(TYMS)［8-11］及丝氨酸羟甲基转移酶 1(serine hydroxymethyltransferase 1，SHMT1)［12］多态性有关。

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