熊 娟

(湖北省黄石市中医医院妇科，湖北黄石 435000)

宫颈癌是三大妇科恶性肿瘤之一，死亡率排名第二，仅次于乳腺癌［1］。宫颈癌特点具有侵袭能力强、恶性程度高、早期可由淋巴结转移、预后差的特点。宫颈癌的发生与发展，经历宫颈不典型增生、原位癌、微小浸润癌、浸润癌等动态演进过程。宫颈癌的发生与发展与基因异常表达、癌基因激活、DNA损伤修复、DNA转录表达失控、抑癌基因失活等相关，最根本的表现为细胞周期调控机制紊乱［2］。细胞周期调控蛋白失调可作为导致肿瘤的原因之一［3］。恶性肿瘤拥有侵袭和转移的最重要的生物学特征，侵袭和转移中药的环节之一就是黏附力降低或者丧失，侵袭、转移与预后密切相关，组织分型、临床分期、分化程度、淋巴转移等因素可反应宫颈癌恶性程度及预后［4］。本文采用免疫组织化学法检测CDK8与KAI1的表达情况，分析两组因子与宫颈癌患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2010年2月—2014年4月黄石市中医医院保存的石蜡组织标本，宫颈癌组织36例，其中宫颈腺癌17例，鳞癌19例。根据2000年FIGO临床分期标准，Ⅰ期15例，Ⅱ期13例，Ⅲ期8例;按病理分化程度，Ⅰ级17例，Ⅱ级11例，Ⅲ级8例;发生淋巴结转移15例，未发生淋巴结转移21例;宫颈上皮内瘤变组织(CIN)110例，其中宫颈低度病变组(CINⅠ50例)，宫颈高度病变组(CINⅡ30例、CINⅢ30例);正常宫颈组织20例。患者年龄29～68岁，中位年龄50岁，患者均未经过放化疗等特殊方式治疗。标本处理:经10%的中性福尔马林固定，石蜡包埋标本，以5 μm厚度切片代用。对36例宫颈癌患者进行1～4年的随访，统计不同分组的死亡率。

1.2 仪器与试剂 免疫组化检测试剂盒、DAB显色液均由福州迈新生物技术有限公司提供，CDK8、KAI1绵羊抗人多克隆抗体由 R＆D公司提供，CDK8、KAI1鼠抗人单克隆抗体工作液由福建迈新生物技术有限公司提供，已知的CDK8、KAI1阳性对照染色片。

1.3 实验方法 (1)CDK8蛋白的检测:采用免疫组织化学染色法，采用二甲苯脱蜡及梯度酒精水化处理切片后，加入少量3%H2O2抑制内源性过氧化酶活性，加入一定量的枸橼酸钠(浓度:0.01 mol·L－1，pH6.0，100℃)修复抗原 10 min 后，用 PBS 冲洗4遍，在10%BSA的环境中封闭非特异性位点10 min。再加入鼠抗人CDK8单克隆抗体于4℃孵育过夜，然后用PBS冲洗3遍，加入CDK8绵羊抗人多克隆抗体于20℃孵育1 h，用PBS冲洗5遍，最后进行DAB显色观察。(2)KAI1蛋白的检测:采用免疫组织化学染色法，操作方法同上，严格按照试剂盒说明书进行实验操作。

1.4 结果判定 CDK8、KAI1结果判定:于400倍光镜下观察，随机选取正常宫颈组织切片、CIN组织切片、宫颈癌切片上5个视野，运用奥林巴斯显微镜拍下视野图像，使用IPP6.0软件处理，将图像灰度值转换成吸光度值，计算出平均吸光度值(OD)=累积吸光度/面积。阳性对照采用已知的阳性对照染色片，阴性对照采用PBS代替鼠抗人CDK8、KAI1单克隆抗体为对照。KAI1阳性表达为在细胞膜或细胞浆内出现棕黄色或黄色颗粒。

2 结果

2.1 CDK8在宫颈癌及 CIN组织中的表达CDK8在组织细胞内阳性表达，细胞核显示为棕黄色。正常宫颈组织中几乎没有阳性细胞(图1a);CINⅢ组织细胞中表达，阳性细胞较正常宫颈明显增加(图1b);宫颈腺、鳞癌组织阳性细胞棕黄色较深，细胞核增大异型(图1c);CDK8在各组间表达，宫颈低度病变组显著强于正常宫颈组(P＜0.05)，宫颈高度病变组显著强于宫颈低度病变组(P＜0.05)，宫颈癌组显著强于宫颈高度病变组(P＜0.05)，见表1。

2.2 CDK8表达与宫颈癌临床特征的关系及预后单因素分析结果显示，CDK8早宫颈癌组织表达与年龄、宫颈癌组织分型、临床分期、细胞分化程度相关因素无关(P＞0.05)，与淋巴结转移有关(P＜0.05)。见表2。对36例患者进行随访结果，临床分期Ⅰ期死亡2例，死亡率13.33%;Ⅱ期死亡3个，死亡率 20.08%;Ⅲ期死亡 3例，死亡率 37.50%。淋巴结转移组死亡7例，死亡率46.67%;淋巴结无转移组死亡4例，死亡率19.05%，淋巴结转移组死亡率显著高于淋巴结无转移组(P＜0.05)。

2.3 KAI1在宫颈上皮内瘤样病变中的表达及预后 正常宫颈组织KAI1可明显观察到棕黄色阳性细胞的存在，随着病情的发展，棕黄色阳性细胞逐渐减少。见图2A～E。KAI1蛋白在正常宫颈组织、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ组织、宫颈癌组织的阳性表达率分别为100%、68.00%、53.00%、40.00%、16.67%;KAI1 在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ组织的表达显著强于在宫颈癌组织(P＜0.05)，在正常宫颈组织、CINⅠ的表达显著强于在CINⅢ(P＜0.05)，在正常宫颈组织表达显著强于在CINⅡ(P ＜0.05)。见表3。

表1 CDK8在各组织表达的平均吸光度比较

表2 CDK与宫颈癌临床特征关系单因素分析结果

表3 KAI1在各组织中阳性表达率

2.4 KAI1表达与宫颈癌临床特征的关系及预后KAI1在宫颈癌组织中的表达均与年龄、组织分型、临床分期、分化程度、淋巴结转移无关(P＞0.05)。见表4。

3 讨论

宫颈癌的发生与发展与基因异常表达、癌基因激活DNA损伤修复、DNA转录表达失控、抑癌基因失活等相关，最根本的表现为细胞周期调控机制紊乱［5］。细胞周期调控蛋白失调可作为导致肿瘤的原因之一［6－7］。主要的细胞周期调控分组有3大类:细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)、细胞周期蛋白(cyckins)、CDK抑制物(CKI)，它们之间相互作用进行精细与复杂的细胞周期调控。CDK是关键调控因子，能启动DNA合成、促进细胞周期时相转变、调控细胞转录，CDK活血受到cyslins正调控和CKIs负调控影响。CDK的活性异常与肿瘤的发生、发展有密切关系［8］。

表4 KAI1表达与宫颈癌临床特征的单因素分析

CDK8属于CDK家族一员，分子量为53～55 Ka，位于基因的13q12、13 段，能与 MED12、MED13、cyclinC结合组成四聚体调控复合物，MED12、cyclinC负责调节CDK8活性，MED13负责聚集CDK8到四聚体调控复合体。人体CDK8还有一种Ser酶，其能调节与 cyclins、CKI结合［9］。现代研究对CKD8具体致癌机制尚未明了，有相关研究表明，CDK8能正向调节RNA聚合酶Ⅱ，间接抑制β-catenin的表达，增加P53转录中得协同激活作用，正向调节EGR转录因子促进细胞生长及血管生成等。目前研究表明CDK8异常表达对大肠癌、胃癌、恶性黑色素瘤的发生有重要的作用。有研究发现，βcatenin、EGR转录因子、P53的异常表达与宫颈癌的发生密切相关，CDK8能正向调节EGR转录因子、P53的表达，负向调节 β-catenin的表达。KAI1蛋白属于四次跨膜超家族成员，分子量为29 610 Ka，长2.4 Kb，由267个氨基酸编码组成，其结构是细胞膜糖蛋白，主要分布在哺乳动物组织细胞及白细胞表面［10］。KAI1蛋白拥有一个大的细胞外亲水结构区和4各高度保守的疏水结构区。KAI1主要参与细胞与细胞外基质、细胞与细胞的相互作用及细胞的增殖活动［11］。KAI1蛋白能抑制肿瘤细胞转移，对细胞活动、黏附能力、转移增生有影响，并通过胞内信号通路介导肿瘤细胞的活动。通过Qac GT Pase和Src激酶抑制肿瘤细胞增殖，激活T细胞与抗原提呈细胞，进而抑制肿瘤细胞转移［12－13］。KAI1可在前列腺癌表达，也可在多种肿瘤(如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、食管癌)组织或者转移病灶中表达，随着病情的恶化，KAI1的表达呈下降或消失趋势［14－15］。KAI1表达下降或者消失，可在不影响原发肿瘤生长的条件下，促进转移瘤形成。本文结果发现，CDK8与患者的生存率和预后有直接关系，KAI1蛋白尚未发现与宫颈癌预后相关。两者之间并未存在直接关联，两者均可在组织或病灶中表达。

DK8在正常组织、CIN低度病变组织、CIN高度病变组织、宫颈癌组织中的表达呈显著递增的趋势(P＜0.05)，CDK8在宫颈癌组织的表达与淋巴结转移呈正相关，36例宫颈癌患者随访后，临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期死亡率分别为 13.33%、20.08%、37.50%，淋巴结转移死亡率(46.67%)显著大于淋巴结无转移(19.05%)，且有显著性差异(P ＜0.05)，随着病情的加重，CDK8表达增强，死亡率增大，说明CDK8的表达与患者的生存率和预后有直接关系;KAI1蛋白在正常宫颈组织、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ组织、宫颈癌组织的阳性表达率分别为 100%、68.00%、53.00%、40.00%、16.67%;KAI1在宫颈癌组织中的表达均与年龄、组织分型、临床分期、分化程度、淋巴结转移无关(P＞0.05);结果提示，KAI1蛋白表达可能与宫颈癌预后没有关系，不能成为宫颈癌预后的一个有效指标。综上所述，CDK8与患者的生存率和预后有直接关系，可作为宫颈癌预后的一项指标，而KAI1蛋白尚未发现与宫颈癌预后相关，需后续研究确认，为临床提供了理论依据。

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