孙肖琛，王 芳，孟 楣，张 贺，陈 娟，李泽庚

(1.安徽中医药大学;2.安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥 230031;3.安徽省芜湖市中医院，安徽芜湖 241000)

芪白平肺胶囊是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂(专利号:ZL2010 1 0573274.1)，由黄芪、生晒参、川芎、地龙、薤白、五味子、葶苈子等七味中药组成。黄芪具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托疮生肌之功效;生晒参具有大补元气、补脾益肺、生津、安神益智之功效;川芎具有活血行气、祛风止痛之功效;地龙具有清热息风、通络、平喘、利尿之功效;薤白具有通阳散结，行气导滞之功效;五味子具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效;葶苈子具有泻肺平喘、利水消肿之功效，七味药合用，可以补气、温阳、化瘀。主要用于治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)，能改善COPD患者肺功能，明显降低COPD患者的中医证候积分，有较好疗效［1－2］。

生晒参对中枢神经系统、心血管系统、消化系统、免疫系统、内分泌系统等有广泛作用，人参皂苷Rb1的现代药理研究表明其具有良好的抗心律失常作用，对心律失常等心血管系统疾病具有治疗改善作用［3－4］，与本制剂的药理药效具有一致性，因此本试验以人参皂苷Rb1为指标，控制该制剂的质量。超高效液相色谱(UPLC)因具有流速低、节省溶剂，保留时间短，分离效率及灵敏度高等优点，已成功应用于化学成分复杂的中药分析领域［5－8］。目前，虽有对制剂中黄芪甲苷［9］、人参皂苷Rg1、Rb［10］1和五味子醇甲［11］含量测定的报道，但未见 UPLCELSD法测定制剂中人参皂苷Rb1含量的研究。已见报道的人参皂苷Rb1含量测定方法有HPLC法，HPLC-ELSD法，RP-HPLC法，UPLC法，UPLC-ELSD法，UPLC-MS-MS 法，LC-MS-MS 法等［12－17］。在前期研究的基础上，为了更好地控制制剂的质量，经过参考相关文献［18－19］，本试验采用UPLC-ELSD 法测定制剂中人参皂苷Rb1含量，为芪白平肺胶囊质量标准研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ACQUITY UPLC(美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、ELSD检测器、Empower2色谱工作站);BP211D十万分之一天平(德国Sartorius公司);Kudos超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 试药与试剂 人参皂苷Rb1购自中国食品药品检定研究院(批号:110704－200921);芪白平肺胶囊由本院制剂中心提供(批号:20130530、20130902、20131121);乙腈、甲醇为色谱纯(美国Fisher)，水为屈臣氏蒸馏水、其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Waters Acquity UPLCBEH C18色谱柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)。

检测器:Acquity ELSD检测器;流动相:乙腈与水不同比例的梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1。

表1 人参皂苷Rb1测定的梯度洗脱条件

流速:0.3 mL·min－1;柱温:30℃;漂移管温度:80℃;氮气纯度:99.9%;氮气压力:24.0 psi。在上述色谱条件下，人参皂苷Rb1可与其它成分基线分离，阴性无干扰，结果见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 称取人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度制得 0.24 g·L－1对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取三批胶囊内容物(批号:20130530、20130902、20131121)各约 1.6 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸移入100 mL锥形瓶中，加水饱和正丁醇50 mL，密塞，放置过夜，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 除去处方中生晒参药材，其余药材按处方比例做成阴性样品，按照“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下人参皂苷 Rb1对照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积的常用对数为纵坐标(Y)，以进样量的常用对数为横坐标(X)，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程 Y=1.616X+6.900;r=0.998 4，表明人参皂苷Rb1在0.24～1.20μg范围内线性关系良好。见图2。

2.4 精密度试验 精密吸取上述“2.2.1”项下的对照品溶液2μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算其RSD为1.5% ，表明仪器精密度良好。见表2。

表2 人参皂苷Rb1精密度试验结果

2.5 稳定性试验 精密称取样品(批号20130530)，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，精密吸取溶液2 μL 分别于0、2、4、8、12 h注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，计算峰面积RSD为1.0%，表明样品在12 h内稳定。见表3。

表3 人参皂苷Rb1稳定性试验结果

2.6 重复性试验 称取同一批号样品(批号20130530)6 份各约1.6 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制成样品溶液，精密吸取2μL，注入超高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，结果表明，样品中人参皂苷Rb1含量RSD为1.1%，重复性良好。见表4。

表4 人参皂苷Rb1重复性试验结果

2.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的胶囊内容物(批号20130530)9份，各约1.6g，分别加入一定量的人参皂苷Rb1对照品，加入量为样品中人参皂苷 Rb1含量的80%，100%，120%，各配制三份，按“2.2.2”项下方法制成待测溶液，精密吸取待测液溶液2μL，按上述色谱条件测定，平均加样回收率为96.88%(RSD=1.28%)，结果见表5。

表5 人参皂苷Rb1加样回收率

2.8 样品含量测定 取 3批样品(批号:20130530、20130902、20131121)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定并计算含量，结果见表6。

3 讨论

3.1 测定指标的选择 2010年版《中国药典》一部人参项下［20］，人参含量测定指标有三个:人参皂苷Rg1、Re、Rb1，在本制剂试验过程中发现 Rg1、Re 位置处的色谱峰有干扰，分离度不够好，不能作为本制剂质量控制指标，而人参皂苷Rb1峰形好，可以与相邻色谱峰较好的分离，故选取人参皂苷Rb1作为质量控制指标。

3.2 测定方法的选择 实验过程中曾尝试采用HPLC-UV法和HPLC-ELSD法测定芪白平肺胶囊中人参皂苷 Rb1的含量。结果，HPLC-UV法末端吸收溶剂，干扰大，且紫外检测器的灵敏度及选择性较差。蒸发光散射检测器可消除溶剂干扰，且基线较平稳，有利于检测人参皂苷Rb1色谱峰。HPLC-ELSD法分离度、重复性等较理想，但与UPLC-ELSD法相比，HPLC-ELSD法出峰时间较长，溶剂用量大，分析效率低等。因此，本试验采用UPLCELSD法对人参皂苷Rb1的含量进行测定，结果该法保留时间短，分析效率高，且进样量少，灵敏度高，溶剂损耗减少。

表6 样品中人参皂苷Rb1含量测定

3.3 流动相的选择 参考2010年版《中国药典》一部人参项下规定［20］，选择乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱，根据实际试验情况，调整乙腈与水的比例，最终确定梯度洗脱程序为:0 min 25%A，1 ～5 min 30%A，5 min 35%A，6 ～8 min 70%A，8～10 min 25%A，结果色谱峰分离度、峰形较好。

3.4 制备方法的选择 选择供试品溶液制备方法时，经试验发现醇提法，无论是回流法、索氏提取法或甲醇超声提取法，人参皂苷Rb1色谱峰分离效果均不理想，而加水超声提取分离效果较好，满足实验要求，故选择水溶液超声处理法。

本实验建立的UPLC-ELSD方法可在短时间内快速分离检测制剂中人参皂苷Rb1，简单、灵敏、准确，可以用于芪白平肺胶囊人参皂苷Rb1含量测定，为该制剂的质量控制提供依据。

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