郝梦梦，王国贺，郭艺红

郑州大学第一附属医院生殖医学中心郑州450052

随着辅助生殖技术的发展，通过卵胞浆内单精子注射(intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI)能够使生精功能轻度抑制的无精症患者生育后代，但ICSI 技术存在的遗传学风险不容忽视［1］。目前临床上尚无有效治疗睾丸内无精子生成的方法，因此寻找生精障碍的分子生物学标志，具有非常重要的意义。蛋白激酶C 相互作用蛋白1(protein interacting with C kinase 1，PICK1)是一个从线虫到人都高度保守的膜周蛋白，在多种组织中表达，其中在脑和睾丸中表达最高［2］。PICK1 蛋白参与体内多种疾病的病理过程，如雄性不育症、疼痛、脑卒中等，并参与多种中枢神经系统疾病及学习和记忆过程［3］。研究［4］发现PICK1 参与小鼠精子顶体的形成，PICK1 基因敲除雄性小鼠出现不育。作者对无精症者睾丸组织中PICK1 蛋白的表达进行了检测分析，探讨PICK1表达强度与精子发生、ICSI 妊娠结局及男性生育力的关系。

1 对象与方法

1．1 研究对象 选择2009年9月至2010年9月于郑州大学第一附属医院生殖中心就诊的无精症患者50例，睾丸容积均≥12 mL;排除染色体核型异常，高泌乳素血症，精索静脉曲张，腮腺炎、结核、淋病等感染后遗症等。无精症诊断依据WHO 统一标准:3次精液离心沉淀后镜检，均未发现精子。根据病理分类及Johnson 评分法，生精功能基本正常(obstructive azoospermia，OA)15例(Johnson 评分8～10分)，生精功能低下(hypospermatogenesis，HS)9例(Johnson 评分6～7 分)，生精功能阻滞(spermatogenic arrest，MA)12例(Johnson 评分4～5 分)，唯支持细胞综合征(sertolicellonly syndrome，SCOS)14例(Johnson 评分1～3 分)。

1．2 睾丸组织中PICK1 的检测 研究对象行经皮睾丸穿刺活检术，标本进行HE 染色，显微镜下观察睾丸组织曲细精管、界膜和间质形态。选择病理切片染色清晰、结构完整的标本，对其相应的蜡块行7 μm 厚切片，并固定于涂有APES 的专用载玻片上，采用免疫组化SP 法检测PICK1 在睾丸组织中的表达，SP 试剂盒购自北京中杉金桥生物技术服务有限公司。阳性染色表现为黄色或棕黄色颗粒状着色。使用HPIA-2000 图文分析系统检测阳性染色的积分光密度(IOD)值。

1．3 治疗 应用ICSI 技术对OA组和HS组行助孕治疗。采用常规黄体期长方案超排卵、卵巢穿刺取卵、体外受精和胚胎移植［5］。移植术后第14 和18天检测血β-HCG，确定是否生化妊娠;术后第35天检查腹部彩超，宫内可见孕囊、胎芽及原始心管搏动者，确定为临床妊娠。

1．4 统计学处理 采用SPSS 13．0 分析，4组睾丸组织中PICK1 蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验;OA组和HS组年龄、不孕年限的比较应用两独立样本t 检验，两组正常受精率、卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率的比较采用χ2检验，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 4组患者睾丸组织中PICK1 表达的比较 各级生精细胞中PICK1 多为强阳性表达，在胞浆或胞核中呈棕褐色着色;在间质细胞及支持细胞中PICK1 呈弱阳性表达或阴性表达(图1)。OA、HS、MA 和SCOS组PICK1 蛋白表达水平分别为(147．67 ±7．48)、(127．79±4．94)、(106．73 ±8．70)和(1．91 ±1．01)，差异有统计学意义(F=1 464．268，P＜0．001)，4组的表达水平依次降低(P＜0．05)。

图1 睾丸组织中PICK1 免疫组化检测结果(SP，×400)

2．2 OA 和HS组ICSI 结局的比较

2．2．1 一般情况 两组男女双方年龄、不孕年限比较，差异均无统计学意义，见表1。

2．2．2 ICSI 结局 见表2。OA组正常受精率高于HS组;两组卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率差异均无统计学意义。

表1 两组一般情况的比较

表2 两组ICSI 结局的比较

3 讨论

男性不育病因复杂，主要原因是精子发生障碍，而精子发生障碍主要由遗传缺陷包括基因突变和染色体异常引起［6］。Xiao 等［4］报道小鼠敲除PICK1基因后表现为精子顶体形成畸形，生精小管凋亡增加，且精子活力严重下降。该研究发现，睾丸组织中PICK1 弱表达的患者，其精子的受精能力低于强表达者，提示PICK1 的表达程度可能与睾丸组织内精子的受精能力相关。

有研究［7］对圆头精子症患者PICK1 基因突变进行了筛查，发现PICK1 基因第13 外显子出现G198A 纯合错义突变，基因突变患者表型与PICK1(－ / －)小鼠表型一致。然而Yatsenko 等［8］对381名畸精症患者GOPC (Golgi-associated PDZ and coiled-coilmotif-containing protein)、PICK1 和ZPBP1(zona pellucida binding protein 1)基因的cDNA 进行了测序，发现ZPBP1 基因突变与精子头部畸形相关，而未发现GOPC、PICK1 基因突变。在不育男性中GOPC、PICK1 基因可能极少发生突变，或许它们与精子成熟的相关性更大。该研究结果显示，精母细胞和精子细胞高表达PICK1 蛋白，而间质细胞及支持细胞低表达甚至不表达，且PICK1 表达强度与睾丸生精功能的强弱有关，推测PICK1 可能参与了精子形成的起始阶段，并在精子成熟过程中起作用，PICK1 蛋白在睾丸组织中表达降低可能是男性生精功能障碍的原因之一。

PICK1 蛋白能与40 多种蛋白相互作用，它包含一个PDZ 结构域和一个BAR 结构域，PDZ 结构域能和许多膜蛋白结合，极有可能成为药物的靶点［9］。通过转基因技术使PICK1 在小鼠睾丸组织中特异性表达可以改善PICK1 敲除小鼠的精子生成异常和不育［10］。因此，PICK1 有可能成为男性不育的新的治疗靶点，若能通过药物促进PICK1 在睾丸组织内表达，可为男性不育患者的治疗提供帮助。由于该研究样本量较少，同时，男性生精功能受多因素影响，因此PICK1 与男性不育的关系仍需要进一步研究、论证。

［1］Johnson MD．Genetic risks of intracytoplasmic sperm injection in the treatment of male infertility:recommendations for genetic counseling and screening［J］．Fertil Steril，1998，70(3):397

［2］Xu JY，Xia J．Structure and function of PICK1［J］．Neurosignals，2006，15(4):190

［3］段贤春，汪永忠，高家荣，等．PICK1 蛋白生理功能及其作为药物新靶点研究进展［J］．中国药理学通报，2013，29(11):1606

［4］Xiao N，Kam C，Shen C，et al．PICK1 deficiency causes male infertility in mice by disrupting acrosome formation［J］．J Clin Invest，2009，119(4):802

［5］Li RR，Dong YZ，Guo YH，et al．Comparative study of pregnancy outcomes between day 3 embryo transfer and day 5 blastocyst transfer in patients with progesterone elevation［J］．J Int Med Res，2013，41(4):1318

［6］Perrin A，Coat C，Nguyen MH，et al．Molecular cytogenetic and genetic aspects of globozoospermia:a review［J］．Andrologia，2013，45(1):1

［7］Liu G，Shi QW，Lu GX．A newly discovered mutation in PICK1 in a human with globozoospermia［J］．Asian J Androl，2010，12(4):556

［8］Yatsenko AN，O＇Neil DS，Roy A，et al．Association of mutations in the zona pellucida binding protein 1 (ZPBP1)gene with abnormal sperm head morphology in infertile men［J］．Mol Hum Reprod，2012，18(1):14

［9］Xia J，Zhang X，Staudinger J，et al．Clustering of AMPA receptors by the synaptic PDZ domain-containing protein PICK1［J］．Neuron，1999，22(1):179

［10］Li X，Mao Z，Wu M，et al．Rescuing infertility of Pick1 knockout mice by generating testis-specific transgenic mice via testicular infection［J］．Sci Rep，2013，3:2842