段丽菊，隋美丽，赵凝秋，李思晨，王如群，胡 婕，陈彬翰

1)郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室 郑州450001 2)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室 郑州450001

△女，1981年11月生，博士研究生，讲师，研究方向:环境毒理学，E－mail:dlj@zzu．edu．cn

近年来，随着经济的快速发展，空气污染物数量急剧增加。汽车尾气中的氮氧化物和挥发性有机物在紫外线的照射下发生光化学反应，产生大量的臭氧，导致大气中臭氧污染极为严重。目前，我国很多大中城市如北京、上海、青岛、郑州等均存在大气臭氧含量超标的现象［1－4］。臭氧具有强氧化性，能强烈刺激呼吸道，造成咽喉肿痛、胸闷咳嗽，引发支气管炎和肺气肿。吸入臭氧会导致肺部上皮层的蛋白质和酯类物质发生氧化作用，生成氧化蛋白和自由基，损伤上皮组织，导致肺部巨噬细胞数量增多并产生细胞毒素、炎症介质［5－6］。臭氧的强氧化性导致肺组织产生的活性氧和活性氮等会继续对组织造成伤害，严重危害人体的健康［7］。一氧化氮(nitric oxide，NO)在许多病理反应中具有介导炎症细胞凋亡、调节炎症反应方向的功能，是一种很活跃的自由基。在炎症反应过程中，NO 可由多种相关细胞产生，如巨噬细胞、中性粒细胞、NK 细胞等。适量的NO 对机体具有保护作用，但过量的NO 具有细胞毒性作用，可损伤肺泡上皮细胞表面磷脂及蛋白，抑制肺泡表面活性物质的生成，促进肺组织的炎性渗出及肺泡的损伤［8］。作者采用体积分数为0．000 1%的臭氧对豚鼠染毒3 h，测定豚鼠肺组织中NO 含量及一氧化氮合酶(NOS)活力，从而研究臭氧暴露对机体肺组织NO 含量的影响，以进一步探讨臭氧所致呼吸道炎症反应可能的机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物 20只3个月龄Dunkin Hartley 豚鼠，普通级，雌雄各半，体重280～350 g，购自北京金牧阳实验动物养殖有限公司，合格证号为SCXK(京)2010－0001。饲养于20～25℃、相对湿度为40%～70%的环境中。每天供给自来水、豚鼠饲料及新鲜蔬菜，动物饮食自由。

1．2 仪器及试剂 HOPE－MED 8050 动态染毒系统(天津开发区合普工贸有限公司)，HH－42 数显恒温搅拌循环水箱(常州国华电器有限公司)，H1650－W离心机(湖南象仪实验室仪器开发有限公司)，XH－C混合器(常州朗越仪器制造有限公司)，V－5800PC型可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)，Z－1200 型臭氧检测仪(美国ESC 公司)，CH－KTB2G 臭氧发生仪(广州创环臭氧电器设备有限公司)，玻璃匀浆器和恒温箱。NO 测定试剂盒、NOS 测定试剂盒、BCA 法蛋白定量测试盒均购自南京建成生物工程研究所，戊巴比妥钠盐购自德国Merck 公司。

1．3 分组与染毒 雌、雄豚鼠均随机分为阴性对照组、臭氧暴露组，每组各10只。暴露前，采用臭氧发生仪，通过调节参数，使之能够稳定地输出染毒所需浓度的臭氧。将臭氧测定仪置于染毒柜中，监测臭氧浓度。待臭氧浓度稳定在体积分数为0．000 1%左右10 min 时将臭氧暴露组豚鼠置于染毒柜中暴露3 h(国际上公认的臭氧急性染毒模型浓度);暴露期间，每5 min 记录一次臭氧浓度。阴性对照组置于通入过滤空气的染毒柜中，臭氧浓度为0，暴露3 h。

1．4 肺组织中NO 含量及NOS 活力的测定 豚鼠于当日上午8:00 开始连续染毒3 h，次日上午8:00麻醉处死，取肺组织迅速置于冰上制成匀浆，3 000 r/min 离心10 min。取组织匀浆上清液，按各试剂盒操作说明书进行NO 含量、NOS 活力测定。

1．5 统计学处理 采用SPSS 21．0 进行分析。分别应用两独立样本t 检验和秩和检验分析两组大鼠肺组织中NO 含量和NOS 活力［应用M(P25，P75)进行描述］的差异，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 臭氧染毒浓度的测定结果 臭氧急性暴露3 h过程中，豚鼠实际暴露剂量为0．000 101% ±0．000 005%，与设定的体积分数为0．000 1%非常吻合，变异系数仅为4．95%，说明用动态染毒系统和臭氧发生仪建立的动态臭氧染毒系统是可靠的。

2．2 豚鼠肺组织中NO 含量和NOS 活力测定结果见表1。1 ppm 臭氧急性暴露3 h 可使豚鼠肺组织中NO 含量升高，但对肺组织NOS 活力无影响。

表1 豚鼠肺组织中NO 含量和NOS 活力测定结果

3 讨论

臭氧作为光化学烟雾的产物之一，是一种普遍存在的城市空气污染物。以往关于臭氧急性暴露的研究中，大多采用体积分数为0．000 1%臭氧连续暴露3 h 的急性暴露模型［9］。相关研究［9－11］表明，臭氧急性暴露可导致肺部发生氧化应激，导致炎症反应的发生，引起气道高反应性，降低肺功能。

作者的研究结果表明，体积分数为0．000 1%臭氧暴露3 h 可导致豚鼠肺组织中NO 含量升高，说明臭氧暴露可导致肺组织发生炎症反应，该研究结果与张景明等［12］的研究结果一致。Modig 等［13］随机选取瑞士5 841 位25～75岁成年人进行研究，通过测定其呼出气中NO 含量，发现人群短期臭氧暴露可导致呼出气中NO 含量增加。Khan 等［14］在研究人体内源性异戊二烯在炎症反应时的生理功能时发现呼出气中NO 含量与所暴露臭氧浓度呈正相关。但Barath 等［15］通过将健康志愿者分别暴露于颗粒物浓度为300 μg/m3的汽车柴油尾气及过滤空气中1 h 和体积分数为0．000 03%臭氧及过滤空气中75 min 进行研究，发现呼出气中NO 含量增高与臭氧无关，而是与柴油尾气相关，提示两者所致的呼吸道炎症反应机制不同，而臭氧所致的急性呼吸道炎症反应不能用呼出气中NO 含量来检测，该研究与以往研究［16－17］结果一致。

肺组织中NO 含量增高的原因可能是NO 合成增加，或代谢减少。机体内NO 合成主要有两种途径:①通过NOS 介导合成。②通过亚硝酸盐还原产生。而体内NO 代谢主要有3种途径:①在有氧条件下，被快速氧化。②与各种分子相互反应，如NO与超氧阴离子反应产生具有很强细胞毒性的过氧亚硝基。③NO 及其衍生物修饰蛋白质半胱氨酸自由巯基，生成亚硝基巯醇。作者的研究结果显示，体积分数为0．000 1%臭氧急性暴露对豚鼠肺组织中NOS 活力无影响，表明臭氧暴露组NO 含量升高并非通过机体内NOS 介导合成增加所致，很可能是臭氧暴露导致机体内亚硝酸盐还原增加或NO 代谢途径受阻所致。具体原因有待更深层次的研究。

NO 作为一种可调节细胞功能的信息分子，具有介导炎症反应的功能，可作为臭氧所致气道炎症反应中的一种介质。同时，NO 也是某些急性肺损伤的损伤因子，可与超氧自由基结合生成过氧亚硝酸盐，导致气道炎症和气道上皮损伤，发挥其毒性作用［8］。臭氧所致炎症反应过程中会产生自由基及活性氧、活性氮，而这些物质本身即可对肺组织造成伤害。这表明，臭氧急性暴露在导致豚鼠肺部发生炎症反应的同时，肺组织中升高的NO 会加重臭氧导致的炎症反应，加大其对肺组织的伤害。

总之，臭氧急性暴露可使豚鼠肺组织中NO 含量升高，但并不影响体内NOS 活力。进一步探讨臭氧急性暴露导致肺组织中NO 含量升高的原因，将有利于研究臭氧所致的肺部炎症损伤的机制，并为臭氧所致呼吸系统损伤的预防与治疗提供依据。

［1］严茹莎，陈敏东，高庆先，等．北京夏季典型臭氧污染分布特征及影响因子［J］．环境科学研究，2013，26(1):43

［2］张爱东，王晓燕，修光利．上海市中心城区低空大气臭氧污染特征和变化状况［J］．环境科学与管理，2006，31(6):21

［3］冯静，董君，陶红蕾．青岛市环境空气臭氧污染特征分析［J］．干旱环境监测，2013，27(4):150

［4］段丽菊，王海雪，高留闯，等．郑州市区春季道路交通高峰期大气臭氧浓度分析［J］．城市环境与城市生态，2013，26(5):37

［5］Ciencewicki J，Trivedi S，Kleeberger SR．Oxidants and the pathogenesis of lung diseases［J］．J Allergy Clin Immunol，2008，122(3):456

［6］Al－Hegelan M，Tighe RM，Castillo CA．Ambient ozone and pulmonary innate immunity［J］．Immunol Res，2011，49(1/3，SI):173

［7］Laskin DL，Sunil VR，Gardner CR，et al．Macrophages and tissue injury:agents of defense or destruction?［J］．Annu Rev Pharmacol Toxicol，2011，51:267

［8］Wu F，Szczepaniak WS，Shiva S，et al．Nox2－dependent glutathionylation of endothelial NOS leads to uncoupled superoxide production and endothelial barrier dysfunction in acute lung injury［J］．Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014，307(12):L987

［9］Gabehart K，Correll KA，Yang J，et al．Transcriptome profiling of the newborn mouse lung response to acute ozone exposure［J］．Toxicological Sciences，2014，138(1):175

［10］Bosson JA，Blomberg A，Stenfors N，et al．Peripheral blood neutrophilia as a biomarker of ozone－induced pulmonary inflammation［J］．PLoS One，2013，8(12):e81816

［11］Devlin RB，Duncan KE，Jardim M，et al．Controlled Exposure of Healthy Young Volunteers to Ozone Causes Cardiovascular Effects［J］．Circulation，2012，126(1):104

［12］张景明，宋宏，郭艳．低浓度臭氧暴露对哮喘大鼠气道炎症的影响［J］．中国药理学与毒理学杂志，2003，17(2):151

［13］Modig L，Dahgam S，Olsson D，et al．Short－Term Exposure to Ozone and Levels of Exhaled Nitric Oxide［J］．Epidemiology，2014，25(1):79

［14］Khan A，Staimer N，Tjoa T，et al．Relations between isoprene and nitric oxide in exhaled breath and the potential influence of outdoor ozone:a pilot study［J］．J Breath Res，2013，7(3):036007

［15］Barath S，Mills NL，Ädelroth E，et al．Diesel exhaust but not ozone increases fraction of exhaled nitric oxide in a randomized controlled experimental exposure study of healthy human subjects［J］．Environ Health，2013，12:36

［16］Olin AC，Stenfors N，Torén K，et al．Nitric oxide(NO)in exhaled air after experimental ozone exposure in humans［J］．Respir Med，2001，95(6):491

［17］Zhang J，Zhu T，Kipen H，et al．Cardiorespiratory biomarker responses in healthy young adults to drastic air quality changes surrounding the 2008 Beijing Olympics［J］．Res Rep Health Eff Inst，2013(174):5