宋亚芹，付文博，卢 沐，刘 洋，魏育涛

0 引 言

微小RNA(microRNA，miRNA)是近年来在真核生物体内发现的长度约22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，能够识别特定的mRNA，并在转录后水平通过促进mRNA的降解或抑制翻译过程而发挥调控基因表达的作用［1］。miRNA在物种进化中具有高度保守性、时序性和组织特异性，其决定组织和细胞的功能特异性，在细胞生长发育过程的调节中起多种作用［2-3］。对miRNA的早期研究认为，绝大多数人类miRNA基因都不成簇存在于基因组内［1］，然而 Altuvia 等［4］通过对 miRNAs基因进行分析后发现，约37%的已知人类基因是成簇存在的［4］，这些基因簇在不同物种间具有较高的保守性，然而它们的生物学意义尚不完全清楚，不过已有实验证实，一些miRNA基因簇在功能上比单个miRNA的作用更高效，多个成员同时作用能更加有效地行使其功能，保证生命活动正常有序地进行［5］。因此，对miRNA基因簇进行相关研究，有利于深入了解其复杂的调控功能。

MiR-106b-25簇涉及肿瘤的增殖凋亡等生物学过程，其成员包括 miR-106b、miR-93和 miR-25，位于人类第7号染色体MCM-7基因的第13内含子处［6］，虽然miR-106b-25簇以多顺反子的形式被转录，但由于其种子序列不同，miR-106b-25簇分属于2个不同的家族:miR-17家族和miR-25家族，前者种子序列为AAAGG，成员包括 miR-106b和 miR-93;后者种子序列为 AUUGCA，成员包括 miR-25。科研多以miR-106b、miR-93及miR-25中一个为研究对象，鲜有以其三者同时作为目标研究相关性。生物信息学是处理大量生物信息的新的研究手段，运用生物学、数学和计算机知识，利用多种数据库，研究和分析生命体各种信息，近年来，生物信息学飞速发展，应用其发现新基因并进行功能研究成为热点［7］。本研究旨在通过生物信息学的方法探索该基因簇所有成员的生物学功能，并进一步分析其家族成员在调控生物学过程中的相互作用，为后续的实验研究提供线索与思路。

1 材料与方法

运用在线靶基因预测软件TargetScan6.1(http://www.targetscan.org/)，PicTar(http:pictar.mdc-berlin.de/)和 miRanda(http://www.microrna.org/)分别预测miR-106b、miR-93和miR-25的靶基因，分别取三者的交集，然后利用miRTarbase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.php)数据库分别寻找这3个miRNA经3种及3种以上实验验证过的靶基因，所得结果与前面的交集组成下一步分析的基因集合。分别将3个基因集合使用GeneOntology(http://geneontology.org/)［8-9］和 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)［10-11］数据库进行生物过程的功能富集分析和基于KEGG数据库的信号通路富集分析，即得到基因集合在富集分析类别上的高频率注释以及有统计学意义的信号转导通路和疾病通路。之后将3个基因集合汇总导入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)数据库(http://string-db.org)［12-13］，得到 3个miRNA靶基因编码蛋白间的相互作用图(PPI)。

GeneOntology进行功能富集分析用到Fisher精确检验和χ2检验，通过多重比较检验，确定功能富集的误判率(false discovery rate，FDR)，完成功能富集分析。信号转导通路富集分析是对基因参与的所有信号通路进行显著性信号转导通路的分析，用到的分析方法同功能富集分析。

2 结 果

2.1 miR-106b-25簇的靶基因预测 TargetScan、PicTar及miRanda预测miR-106b的靶基因得到交集6个，结合miRTarbase中实验验证的靶基因8个，得到靶基因集合14个;同法预测miR-93得到交集17个，实验验证8个，得到靶基因集合25个;预测miR-25得到交集28个，实验验证16个，得到靶基因集合54 个，见表1。虽然TargetScan、PicTar、miRanda的预测方法不同，但均以保证miRNA与相应靶基因的序列保守性为基础，故所得交集靶基因与相应miRNA结合具有较高的保守性。

表1 miR-106b-25簇的预测靶基因Table 1 Predicted target genes of the miR-106b-25 cluster

2.2 miR-106b-25簇的生物过程富集分析及KEGG通路分析 分别将miR-106b、miR-93、miR-25 3个基因集合作为靶基因集合通过GeneOntology(http://geneontology.org/)和 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)数据库进行生物过程富集分析和基于KEGG数据库的信号通路富集分析，结果显示3个miRNA的生物过程集中富集于:新陈代谢调节、细胞周期调节、细胞增殖及投射等生物学过程，见表2。

表2 miR-106b-25簇的生物学过程富集分析Table 2 Biological process enrichment of the miR-106b-25 cluster

三者的pathway通路富集分析明显集中于:胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌等肿瘤相关通路上，见表3。

2.3 靶基因编码蛋白间的相互作用 将三者的靶基因集合汇总后通过STRING在线分析软件(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，http://www.String-db.Org/)分析靶基因编码蛋白间的相互作用并做出蛋白互作图，见图1。图中显示miR-106b-25簇3个成员靶基因编码蛋白间具有复杂的相互作用，尤其是靶基因KAT2B、PTEN、TP53、CDH1、MDM2、E2F1、RB1、SMAD7 编码蛋白在互作网络中起到稳定结构的作用，而它们分属于miR-106b-25簇的3个成员。

图1 miR-106b-25簇的靶基因编码蛋白互作图Figure 1 Protein-protein interaction network of the miR-106b-25 cluster

3 讨 论

有研究指出，对不同肿瘤中的miR-106b-25基因簇进行抑制，发现肝癌细胞发展周期明显减慢，3个成员的表达效果虽然不同，但是趋势相同，表明该基因簇的成员在肿瘤细胞发生发展中起到一定作用［14］。我们的研究结果显示，miR-106b-25簇3个成员靶基因集合的生物学过程明显富集于细胞代谢过程及细胞分裂周期，而另有研究表明miR-106b-25簇参与了细胞G1/S期的转换，这一功能主要涉及RB通路［15］，在一些有关胃癌的研究中也发现，miR-93、miR-106b和miR-25通过调控细胞周期而影响细胞生长［16］，揭示了位于同一簇的miRNA在功能上的相关性。目前为止关于miR-93及miR-106b与细胞周期G1/S期的转换关系已有相关研究:miR-93可以促进肝癌细胞生长，促进细胞周期的 G1/S期转换［17］;miR-106b可以提高E2F转录因子的活性来促进G1/S期转换，同时也促进细胞增殖［18］。但有关miR-25与肿瘤细胞周期的研究还很少，这为下一步的课题提供了研究思路。既然miR-106b-25簇的成员间具有较强的功能相关性，我们猜测miR-25也参与促进细胞周期的G1/S期转换。

KEGG通路富集分析显示miR-106b-25基因簇靶基因集中于各种肿瘤通路中，其成员编码的下游靶蛋白中，处于核心位置的有E2F1、PTEN、SMAD7、CDH1、KAT2B、TP53、MDM2 及 RB1。而前 4 种蛋白与miR-106b-25基因簇的关系研究已有相关报道:miR-106b-25基因簇对肿瘤细胞的作用可能主要通过转化生长因子β而发挥，而在它们之间存在一个重要的转录因子E2F1，其对于两者之间的关联以及肿瘤细胞的进展具有很大影响［19-20］，同时E2F1上调还会促进细胞周期中G1/S期的转化，对肿瘤细胞的周期产生影响［21］;PTEN作为一种肿瘤抑制因子，有抑制细胞增殖的作用，这种肿瘤抑制蛋白受到miR-106b-25簇的抑制，并且这种抑制与miR-106b-25簇的成瘤性有关［22］。有研究显示PTEN对细胞p13k/AKT通路具有重要影响，通过调控细胞周期诱导细胞凋亡的方式阻止肿瘤细胞的生长，然而在前列腺癌和卵巢癌中miR-93可以靶向结合PTEN，降低PTEN表达，从而促进癌细胞增殖和侵袭［23-25］;Smith 等［26］在对乳腺癌的研究中发现，Six1表达上调可激活miR-106b、miR-93和miR-25的表达，从而调控肿瘤的转移过程，miR-93还可通过靶向调节SMAD7基因作用于TGF-β信号通路并引起肿瘤细胞发生上皮-间质转移。CDH1是一种重要的细胞黏附分子，参与细胞分化，抑制细胞迁移，在多数癌组织的细胞表面都存在CDH1的减少或消失，以致癌细胞黏附力减弱从而易从瘤块脱落，成为侵袭与转移的前提，Xu等［27］研究发现miR-25通过调控下游靶蛋白CDH1促进食管癌细胞的侵袭与转移。上述报道中的因子与我们通过生物信息学分析预测出来的靶基因中处于核心地位的靶基因吻合，提示我们生物信息学分析的结果与后期实验验证的结果具有一定的一致性，但目前关于KAT2B、TP53、MDM2、RB1与miR-106b-25簇的研究还很有限，需要我们进一步验证。

肿瘤的发生发展不可能经由单个蛋白而实现，通过蛋白互作图可看出各种靶蛋白之间存在复杂的相互作用，据此可推测miR-106b-25簇中的3个成员相互作用，通过调控细胞周期的转换参与肿瘤通路过程进而调节多种下游靶蛋白促进或是抑制肿瘤的发生，尤其是处于核心地位的 E2F1、PTEN、SMAD7、CDH1、KAT2B、TP53、MDM2 及 RB1，后5 种蛋白更是急需实验进行相关验证。这一结果提高了我们针对miRNA的研究效率，不仅为预测基因提供了重要信息，还为进一步的实验提供了研究目标。

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