CD46 CD55 CD59在结肠癌组织中的表达及意义

2015-11-23顾勇杨艳尚玉龙孟宏涛

中国肿瘤临床 2015年6期

顾勇杨艳尚玉龙孟宏涛

·临床研究与应用·

顾勇①杨艳②尚玉龙②孟宏涛①

目的：检测CD46、CD55、CD59在结肠癌组织中的表达情况，分析其与结肠癌临床病理参数间的相关性及意义。方法：选取有详细性别、年龄、组织分化、病理分期、肿瘤部位、组织类型资料的组织芯片标本，包括121例结肠癌和121例癌旁结肠组织，均为2004年10月至2006年6月第四军医大学西京消化病医院胃肠外科手术切除标本。应用免疫组织化学改良二步法分别检测CD46、CD55、CD59的表达情况。结果：CD46、CD55及CD59在结肠癌组织中的阳性表达率均显著高于对应的癌旁组织（P＜0.001）。CD46表达水平与性别、年龄、组织分化、TNM病理分期、肿瘤位置、病理组织类型均无关（P＞0.05）。CD55、CD59的表达水平与性别、年龄、肿瘤位置、病理类型无关（P＞0.05），而与组织分化、TNM病理分期有关（P＜0.05）。其表达强度阳性率中低分化组明显高于高分化组（P＜0.05）。TNM分期中Ⅲ、Ⅳ期患者肿瘤病理组织强阳性表达率高于Ⅰ、Ⅱ期阳性表达率，两者比较有统计学意义（P＜0.05）。结论：CD46、CD55及CD59在结肠癌组织中高表达，特别是CD55、CD59的表达与肿瘤分化、病理分期相关，提示三者表达水平与结肠癌生物学行为密切相关。

CD46 CD55 CD59 结肠癌免疫组织化学

随着单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）介导的肿瘤免疫治疗应用于临床，补体效应系统的作用日益受到重视，mAb主要通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）、补体激活介导的细胞毒性作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）等途径间接或直接杀伤并抑制肿瘤细胞生长，而后者的作用更为重要［1-2］。补体依赖的细胞毒性针对肿瘤细胞的靶向作用，是

破坏性的、不可逆的，补体激活受补体调节蛋白（complement regulatory proteins，CRPs）调控。膜结合补体调节蛋白（membrane-bound complement regulatory proteins，mCRPs）是CRPs存在的一种形式。mCRPs主要包括CD46、CD55和CD59，也称作膜辅蛋白（membrane cofactor protein，MCP），几乎在所有类型的细胞中都有表达。已有研究显示，mCRPs在肿瘤细胞中的异常表达可使肿瘤细胞逃避补体的攻击，产生免疫逃逸［3-4］。目前mCRPs在结肠癌组织中的表达与调控作用报道很少。本研究应用免疫组织化学法检测结肠癌组织中CD46、CD55、CD59的表达情况，为进一步深入探讨与结肠癌发生发展相关的mCRPs生物学功能，寻找新的肿瘤治疗的潜在基因靶点提供有力依据。

1 材料与方法

1.1组织标本

所有组织标本均取自于组织芯片，本实验中的结肠癌及相匹配的癌旁组织芯片由西安艾丽娜生物科技有限公司、第四军医大学病理科提供，121例结肠癌和121例癌旁结肠组织均为2004年10月至2006年6月第四军医大学西京消化病医院胃肠外科手术切除标本，其中男75例，平均40～74岁，中位年龄61岁；女46例，平均31～82岁，中位年龄55岁。所有患者均未行化疗、放疗或生物治疗（表1）。本项研究经第四军医大学伦理委员会批准。

表1 CD46的表达和结肠癌临床病理学指标之间的关系Table 1CD46 expression in normal and neoplastic colon tissues

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色采用免疫组织化学改良二步法分别检测CD46、CD55和CD59的表达。方法如下：切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水。3%双氧水灭活内源性过氧化物酶12 min。PBS洗涤3 min×3次。0.4 g柠檬酸/3g柠檬酸钠混合溶液（1L，pH 6.0）进行抗原修复。PBS洗涤3 min×3次。分别滴加CD46、CD55和CD59（1:100或1:200，美国Santa公司）一抗稀释液4℃过夜。用小鼠IgG代替一抗作为阴性对照。PBS洗涤5 min×3次。滴加辣根过氧化物酶标记二抗（Santa Cruz），室温孵育30 min。PBS洗涤5 min×3次。DAB显色约2 min。苏木素复染3 min。梯度酒精脱水，二甲苯浸泡，中性树脂封片。待干燥后显微镜下观察。

1.2.2结果判定由3位观察者采取盲法观察，每张切片选5个视野（×200倍），每个视野计数150个细胞，观察癌细胞及癌旁黏膜的染色情况，评分方法如下［5］：1）依据细胞染色强弱，无着色为0分，浅黄或浅褐色为1分，棕黄或褐色为2分，深褐色为3分。2）依据阳性细胞比例＜25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。3）以上两者乘积为最终评分：0～4分为弱表达，5～12分为强表达。

1.3统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件，采用非参数检验分析CD46、CD55和CD59蛋白与临床病理参数间的关系，两组之间比较采用Mann-Whitney U检验，多组之间使用Kruskal-Wallis检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1CD46在结肠癌和癌旁组织中的定位与表达

免疫组织化学检测CD46在121例结肠癌组织中的表达情况，结果显示CD46主要定位于细胞质，部分为胞膜表达。CD46蛋白在结肠癌与癌旁组织中强阳性表达率分别为53.7%（65/121）和11.0%（11/ 124）。两者比较差异有统计学意义（P＜0.001）。进一步分析与临床病理参数间的相关性，发现其表达阳性率与性别、年龄、组织分化、TNM病理分期、肿瘤位置、病理组织类型均无关（P＞0.05，图1，表1）。

图1 SP免疫组织化学法检测CD46在结肠癌组织及癌旁组织中的表达Figure 1Immunohistochemical staining of CD46 in normal and neoplastic colon tissues

2.2CD55在结肠癌和癌旁组织中的定位与表达

本实验显示CD55主要分布于结肠癌组织的胞浆和胞膜，在间质细胞中也有少量表达。121例结肠癌组织中有77例（63.6%）CD55染色强阳性，而在癌旁组织中染色强阳性率为5.8%（7/121）。CD55在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，具有统计学意义（P＜0.001，图2，表2）。分析表达水平与临床病理参数间的相关性（表2），CD55的表达与TNM分期和组织学类型相关（P＜0.05），但与年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤病理类型无相关性（P＞0.05）。而且观察到CD55的表达组织学类型不同，定位有所不同：高分化以胞膜表达为主，中低分化主要定位于细胞质（图2）。

2.3CD59在结肠癌和癌旁组织中的定位与表达

CD59和CD46、CD55类似，也主要分布于结肠癌组织的胞浆和胞膜，但在间质细胞未见有表达。121例结肠癌及其相对应的癌旁组织中强阳性表达率分别为61.9%（75/121）和6.6%（8/121），阳性率有显著统计学差异（P＜0.001，图3、表3）。CD59的表达阳性率与性别、年龄、肿瘤位置、病理类型无关（P＞0.05），而与组织分化、TNM病理分期有关（P＜0.05）。其表达强度阳性率中低分化组明显高于高分化组（P＜0.05，图3）。TNM分期Ⅰ、Ⅱ期强阳性表达率为51.1%（24/47），Ⅲ、Ⅳ期阳性表达率为68.9%（51/74），两者比较有统计学意义（P＜0.05）。

表2 CD55的表达和结肠癌临床病理学指标之间的关系Table 2CD55 expression in normal and neoplastic colon tissues

图2 SP免疫组织化学法检测CD55在结肠癌组织及癌旁组织中的表达Figure 2Immunohistochemical staining of CD55 in normal and neoplastic colon tissues

图3 SP免疫组织化学法检测CD59在结肠癌组织及癌旁组织中的表达Figure 3Immunohistochemical staining of CD59 in normal and neoplastic colon tissues

表3 CD59的表达和结肠癌临床病理学指标之间的关系Table 3CD59 expression in normal and neoplastic colon tissues

3 讨论

结直肠癌位居全球癌症发病率第三位，其病因和发病机制尚不清楚，在临床上缺乏有效的早期诊断方法，大多数的患者确诊时已处于进展期，往往最终死于肿瘤浸润、转移、术后复发和化疗后多药耐药。因此深入探讨结肠癌发生发展的分子机制对于

早期诊断、疗效预测和判定及改善患者预后均具有十分重要的意义。

以往对mCRPs的研究［6-7］多集中在其调节补体介导的免疫反应方面，而本试验使用了基因芯片大规模检测结肠癌mCRPs中CD46、CD55和CD59的表达定位及相对表达量。结果提示三者在结肠癌中的表达阳性率明显高于对应的癌旁组织，且CD55和CD59的表达强度与TNM分期和组织学类型密切相关，同时还发现其表达定位主要分布在腺上皮细胞的细胞质和细胞膜，间质细胞很少有表达。Koretz等［8-9］研究结果显示CD46在结肠癌组织及正常组织均有高表达，CD59在结肠癌组织中弱表达，但其研究样本量仅有20例，病理学指标也未细化分类。

由于mCRPs的活性效应，肿瘤细胞和正常细胞对同源补体的攻击高度耐受。肿瘤细胞在免疫逃逸中，通常不仅仅过表达一种mCRPs，可能是多种［10］。关于补体调节蛋白具备的这种针对肿瘤细胞的保护机制，已有多项体外研究。本文研究显示，这些补体调节剂在结肠癌中表达增强，表明mCRPs在保护结肠癌细胞免于补体的攻击中发挥着特殊作用。这种现象在乳腺癌中也存在，mCRPs灭活之后，乳腺癌细胞系的CDC可由10%增加到80%［11］。但是各补体调节蛋白在不同肿瘤、不同病理类型中作用也大有不同。在恶性胶质瘤患者中，CD55蛋白的表达与逃避补体介导的攻击能力呈正相关，而神经胶质瘤CD46灭活之后，CDC并无太大变化［12］。对利妥昔单抗（rituximab）治疗反应较差的慢性淋巴细胞白血病患者外周血分离的淋巴细胞，体外中和CD55、CD59后对于补体活化、裂解更为敏感［13］。另外，抑制CD59活性，肾癌细胞对于CDC的敏感性明显增强，而CD46、CD55则无此效应。本研究发现CD46在结肠癌中高表达，但与组织分化、病理分期无关，可能提示在肿瘤细胞免疫逃逸中，该蛋白发挥着主要功能。CD55和CD59表达强度在低分化组和Ⅲ、Ⅳ期患者中明显升高，可认为补体调节蛋白表达模式在预测生物免疫治疗中患者的免疫应答率方面意义重大，并且可能与结肠癌的临床预后相关。一项136例结直肠癌的有关研究显示，CD55高表达患者相对生存时间减少了7年，并且术后复发率较高［14］。

已有的体内体外实验研究表明，抑制mCRPs的功能可增强CDC，促进肿瘤免疫治疗的效果。尤其是双特异性抗体的使用能有效靶向肿瘤细胞的mCRPs，给免疫治疗带来了新的希望［15-17］。有文献报道，mCRPs在结肠癌中的表达受肿瘤坏死因子α、1β、γ调控，使用细胞活素类药物下调mCRPs的表达可能也是以后肿瘤治疗的一个选择［18］。另外本研究通过评估mCRPs的表达情况可判断患者是否适合免疫治疗并预测免疫应答率。总之，在结肠癌中监测mCRPs的表达对于了解疾病的进展和预后有重要价值，并为我们下一步探讨与结肠癌发生发展相关的mCRPs及作用机制、寻求新的治疗策略开辟了新的思路。

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（2015-01-23收稿）

（2015-03-12修回）

（编辑：郑莉）

Expression of CD46,CD55,and CD59 in colon cancer

Yong GU1,Yan YANG2,Yulong SHANG2,Hongtao MENG1

Hongtao MENG;E-mail:mhtmyt@163.com

Objective:To determine whether CD46,CD55,and CD59 are differentially expressed in neoplastic and adjacent normal colon tissues and to investigate their influence on clinicopathologic variables.Methods:Immunohistochemistry(a modified twostep method)was used to detect the expression of CD46,CD55,and CD59 in a tissue microarray of 121 cases of colon cancer and corresponding adjacent non-tumor tissues with detailed clinical information,including gender,age,differentiation,TNM classification,tumor location,and tumor histotype.The colon carcinoma microarray was constructed from patients'samples obtained from the Department of Gastrointestinal Surgery of Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University between October 2004 and June 2006. The correlation between expression and clinicopathologic features was analyzed.Results:The expression levels of CD46,CD55,and CD59 were significantly higher in colon cancer tissues compared with those in normal adjacent colon tissues(P<0.001).CD46 expression was not related to any specific patient characteristics,such as age,gender,grade of tumor differentiation,or TNM classification(P> 0.05).The expression levels of CD55 and CD59 were correlated with the grade of colon cancer differentiation.Low levels of CD55 and CD59 were detected in cancer cells of highly differentiated cancer,whereas stronger staining for CD55 and CD59 was mainly observed in cancer cells of moderately and poorly differentiated colon cancer(P<0.05).In addition,the expression levels of CD55 and CD59 were higher in stages III and IV colon cancer than those in stages I and II according to TNM classification(P<0.05).Conclusion: CD46,CD55,and CD59 are up-regulated in colon cancer.Specifically,CD55 and CD59 are of clinical relevance to differentiation and TNM staging of colon cancer,and their expression might be closely related to clinical biological behaviors.

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