王宇豪　赵冬香　王玉洁　刘俊峰　高景林　刘桂琼

（1中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口571101；2华中农业大学动物科技学院动物医学院，武汉430070）

中华蜜蜂头部乙酰胆碱酯酶最佳反应体系的建立

王宇豪1，2赵冬香1王玉洁1刘俊峰1高景林1刘桂琼2

（1中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口571101；2华中农业大学动物科技学院动物医学院，武汉430070）

乙酰胆碱酯酶是昆虫体内重要的生化标记物，利用其活性的变化可以监测农药对昆虫的亚致死效应。乙酰胆碱酯酶活性测定的条件会因为来源于不同的物种甚至同一物种不同部位而改变。本文采用正交试验排列的25个组合试验探究了酶浓度、底物浓度、pH、反应温度及反应时间5个因素对测定中华蜜蜂头部乙酰胆碱酯酶比活力的影响，并从中选择出最佳测定组合。试验结果表明，5个因素对中华蜜蜂头部乙酰胆碱酯酶比活力影响的大小顺序为酶浓度＞反应温度＞pH＞反应时间＞底物浓度，各因素最佳组合为酶浓度0.25g/L、底物浓度0.8mmol/L、pH值7.5、反应温度40℃及反应时间5min。本文优化了中华蜜蜂头部乙酰胆碱酯酶测定条件，为今后评估有机磷类、氨基甲酸类和新烟碱类杀虫剂提供条件。

中华蜜蜂；乙酰胆碱酯酶；正交试验；最佳测定条件

蜜蜂作为具有重要的生态价值和经济价值的社会性昆虫［1］，在维系物种多样性和农业发展中具有不可替代的作用。全球约87.5%的显花植物需要昆虫传粉，而蜜蜂约占传粉昆虫总数的80%，人工饲养和野生存在的蜜蜂都在传粉方面有着重要的作用［2-4］。我国作为一个农业大国，农药的广泛使用对蜜蜂的安全造成了严重的威胁，保护蜜蜂的相关工作刻不容缓。

中华蜜蜂Apis cerana cerana，简称中蜂，其具有嗅觉灵敏，抗螨、抗巢虫能力强，善于利用零星分散的蜜粉源，抗寒耐热，消耗饲料少等特点［5-7］。研究表明，与意大利蜜蜂相比，中华蜜蜂对药剂更敏感，一些对意大利蜜蜂低毒的药剂，可能会造成中华蜜蜂的大量中毒死亡［8］，因此有必要开展农药对中华蜜蜂影响相关研究。

乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）是用来检测生态环境中农药存在情况的几种生物化学标记酶之一，是有机磷和氨基甲酸类农药的靶标酶。在小熊熊蜂［9］、中华蜜蜂和意大利蜜蜂［10,11］及其他多种生物［12-15］中均有研究报道。新烟碱类农药作为有机磷和氨基甲酸类农药的新一代神经毒剂替代品，其也能对乙酰胆碱酯酶的活性产生影响［11,16,17］。本研究采用正交试验设计，对多个影响中华蜜蜂头部乙酰胆碱酯酶活性测定的因素进行研究，并找出最佳测定组合，为今后的研究奠定基础。

1　材料和方法

1.1供试蜂群

中华蜜蜂（以下简称中蜂）采集蜂，由中国热带农业科学院环境与植物保护所试验蜂场提供（N 19°32′, E 109°32′）。供试蜜蜂要求取自同一蜂群，身体状况良好、饲喂状况一致。

1.2仪器设备与试剂

电子天平（XS 365M-SCS），瑞士Precisa公司产品；紫外-可见分光光度计（UV-2450），日本SHIMADZU公司产品；高速冷冻离心机（5810R），德国Eppendorf公司产品；循环水浴锅（9012），美国Poly Science公司产品。

考马斯亮蓝G-250为Solarbio公司产品；5,5'-二硫双硝基苯甲酸（5,5′-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid, DTNB）与碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide, ATCI）为Xiya Reagent公司产品；牛血清蛋白、无水乙醇、95%乙醇、磷酸、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均为国产分析纯。

1.3酶液制备

每次取6头中蜂，低温麻醉后，将其头部剪下，放入1.5mL离心管中，加入液氮迅速用研磨棒磨成粉末，加入预冷的不同pH的0.1mol/L的磷酸缓冲液（0.1% Triton X-100）稍加匀浆，15000g离心20min，取上清液作为酶源。

1.4乙酰胆碱酯酶（AChE）活性测定

采用Gorun［18］改进的Ellman方法测定乙酰胆碱酯酶活性。取待测酶液0.2mL与0.2mL ATCI混匀，不同处理按照正交组合中的不同要求分别进行不同时间的反应后，加入1.8mL显色剂（DTNB）并终止反应，用紫外分光光度计测定OD412，重复3次。

其中：△OD=OD/反应时间（单位为min），V为反应总体积（单位为mL），ε为产物与DTNB络合物的摩尔消光系数=13600L/mol·cm，L为比色杯的光程1 cm，mg为酶液中蛋白质含量。

1.5蛋白质含量的测定

参照Bradford［19］考马斯亮蓝G-250法。用牛血清白蛋白（BSA）测定蛋白质含量标准曲线。取1 mL待测粗酶液（调整蛋白质含量在20～100μg范围内），加入5mL考马斯亮蓝G-250染色液，混匀后2min～1h内测OD595值。由标准曲线计算粗酶液中蛋白质的含量。

1.6正交试验设计

根据张莹等［10］试验方法进行酶促反应正交试验，主要影响因素包括酶浓度、底物浓度、反应时间、反应温度及反应体系的pH（表1），采用的正交表为L25（56）。

表1　正交试验中的影响因素及水平

1.7统计方法

将测得25组吸光值用Excel处理，算出每组比活力。

运用SPSS 19.0软件，对25组数据进行极差分析、方差分析、各水平间差异显著性检验。极差分析法初步确定5因素对乙酰胆碱酯酶比活力影响大小的顺序及各因素中最优水平，F检验可以用于验证极差分析法得出的结论。若由于F检验同一因素不同水平间呈极显著关系，可以进行各水平间差异显著性检验（SSR检验）。

2　结果与分析

正交试验结果的极差大小，表明了不同因素不同水平试验条件对试验结果的影响（表2）。

表2　不同正交处理组合下中蜂头部AChE的比活力值

表3是对表2进行极差分析得出的结果，显示各因素对中蜂头部AChE比活力的影响大小顺序为：酶浓度＞反应温度＞pH＞反应时间＞底物浓度。酶浓度极差最大，则表示酶浓度对中蜂头部AChE比活力的影响最大。从表3计算出的ki结果也能很直观得出各影响因素的最优水平。A因素最优水平是1，即酶浓度为0.25g/L；B因素最优水平是3，即底物浓度为0.8 mmol/ L；C因素最优水平是4，即反应体系pH为7.5；D因素最优水平是4，即反应温度为40℃；E因素最优水平是1，即反应时间为5 min。

将试验结果进行方差分析和F检验。结果表明，5个因素对中蜂AChE比活力的测定结果的差异均达到极显著水平。F值的大小也表明了5个因素对中蜂AChE比活力影响大小顺序，其结果与极差分析法结果相一致（表3和表4）。

表3　正交试验极差分析结果

F检验结果显示，5个因素对中蜂AChE比活力测定的差异均达到极显著水平（表4），需要进行因素内5个不同水平之间的差异性检验，由此选出测定中蜂AChE比活力的最优组合条件水平。Duncan法（新复极差法）测定表明，各因素条件下，酶浓度的第一水平、底物浓度的第三水平、pH的第四水平、反应温度的第四水平及反应时间的第一水平显著高于其他各个水平，与极差分析法结果一致（表5）。

表4　L25（56）正交试验方差分析表

表5　正交试验5个影响因素各水平差异显著性检验（SSR检验）

可见，5个因素对中蜂头部AChE比活力都有显著的影响，因此在测定中蜂头部AChE比活力的时候需要对这5种因素进行严格的控制。试验结果表明，测定中蜂头部AChE比活力最佳条件组合为酶浓度0.25g/ L、底物浓度0.8mmol/L、pH值7.5、反应温度40℃及反应时间5min。

3　讨论

乙酰胆碱酯酶活性测定的条件会因为来源于不同的物种甚至同一物种不同部位而改变。研究表明，酯酶测定条件通常在最适pH、底物浓度及反应温度上有所改变［20］。众所周知，酶浓度对于酶活性也有一定程度的影响，而随着时间的推移、反应的持续进行，底物浓度有所改变，酶活性也会有变化，所以反应时间与酶的比活力值间有重要相关性。因此，有必要在测定中蜂头部AChE比活力之前，针对酶浓度、底物浓度、反应pH、反应温度及反应时间5个因素进行试验，确定最适中蜂头部AChE比活力测定的条件。

当反应系统中的底物浓度足够大时，酶促反应速度与酶浓度成正比，但在保证试验结果可信的前提下，应尽量减少试验材料（蜜蜂头部）的使用量，且比活力的计算与蛋白质浓度相关，合适的蛋白质浓度对试验结果也有很大的影响。一般的酶，在酶浓度一定的情况下，酶促反应速率会随着底物浓度的增加而增加，直至趋于一个稳定的最大速率，但过量的底物浓度会抑制AChE活性［21］。pH对酶促反应的影响，从图形上来看，通常为一钟形曲线，即pH过高或者过低均会导致酶蛋白变性降低甚至失去活性，且如果pH高于8.0，用于试验的显色剂DTNB会发生水解，影响试验结果［20］。酶促反应依赖于温度，随着温度的升高，酶促反应速率会极速增加，但若高于某一温度时会导致酶蛋白变性降低活性或失活，最适温度即为平衡点。不同的酶或不同物种不同组织来源的酶，最适温度会有所不一样。反应时间与酶比活力的线性关系只在一定范围内成立，随着反应的推移，酶比活力会下降。

国内外学者已对多种物种AChE测定条件做过研究。如星豹蛛Pardosa astrigera［22］、美洲蟑螂Periplaneta Americana［15］、鲫鱼Carassius auratus［23］、黑翅土白蚁Odontotermes formosanus［13］、花翅摇蚊Chironomus kiiensis［12］、小峰熊蜂Bombus hypocrite［9］、意大利蜜蜂A.mellifera ligustica［10］等物种特定部位AChE活性测定条件已有研究。不同物种不同组织AChE活性的测定条件各异，但蜜蜂种属的测定条件基本一致。

乙酰胆碱酯酶是用来检测生态环境中污染物存在情况的几种生物化学标记酶之一，在检测有机磷和氨基甲酸酯类农药中有着广泛的运用。本实验结果提供了在海南地区利用中蜂测定有机磷和氨基甲酸酯类农药毒性依据的同时，下一步研究将会利用中蜂头部乙酰胆碱酯酶对新烟碱类杀虫剂进行相关方面的研究。

［1］郑火青,胡福良.蜜蜂—新兴的模式生物.昆虫学报,2009,52（2）:210－215.

［2］Ollerton J,Winfree R,Tarrant S.How many flowering plants arepollinated by animals［J］Oikos,2011,120（3）:321－326.

［3］Gill RJ,Ramos-Rodriguez O,Raine N E.Combined pesticideexposure severely affects individual-and colony-level traits in bees［J］.Nature,2012,491（7422）:105－108.

［4］Garibaldi L A,Steffan-Dewenter I,Winfree R,et al.Wildpollinators enhance fruit set of crops regardless of honey beeabundance［J］.Science,2013.339（6127）:1608－1611.

［5］王凤鹤,杨甫,耿金虎,等.北京中华蜜蜂的保护与利用.昆虫知识,2007,44（6）:144-148.

［6］周冰峰,朱翔杰.论中华蜜蜂种质资源的保护//蜂产品信息交流会论文集［C］.福州:2009.

［7］余林生,孟祥金.意大利蜜蜂与中华蜜蜂授粉生态之比较［J］.养蜂科技,2001（6）:9-10.

［8］王瀛寰,张艳峰,张旭,等.五种农药对中华蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂的经口毒性比较［J］.农药学学报,2012,14（4）:453-456.

［9］廖秀丽,罗术东,伍翔,等.小峰熊蜂头部乙酰胆碱酯酶测定条件的优化及其对六种常用杀虫剂的敏感性［J］.昆虫学报.2011, 54（12）:1361-1367.

［10］张莹,黄建,高希武.正交试验法确定测定意大利蜜蜂头部乙酰胆碱酯酶反应的最佳条件.昆虫学报.2005.48（4）:627-632.

［11］Badiou A,Meled M,Belzunces L P.Honeybee Apis melliferaacetylcholinesterase-a biomarker to detect deltamethrin exposure. Ecotoxicol Environ Saf,2008,69:246-253.

［12］刘洪霞,史雪岩,高希武.摇蚊乙酰胆碱酯酶最佳反应体系的建立及有机磷类药剂敏感性比较［J］.安全与环境学报,2005,5（5）:67-70.

［13］汤方,杨海江,高希武.黑翅土白蚁乙酰胆碱酯酶最佳反应体系的建立及药剂敏感度比较［J］.昆虫学报,2008,51（7）:714-719.

［14］Mdegela RH,Mosha RD,Sandvik M,et al.Assessment of acetylcholinesterase activity in Clarias gariepinus as a biomarker of organophosphate and carbamate exposure［J］.Ecotoxicology,2010, 19（5）:855-863.

［15］何绍志,李维,王雁,等.美洲蟑螂头部乙酰胆碱酯酶酶活性测定及对5种常用农药的敏感性.食品科学,2013,34（23）:184-188.

［16］Boily M,Sarrasin B,Deblois C,et al.Acetylcholinesterase in honey bees（Apis mellifera）exposed to neonicotinoids,atrazine and glyphosate:laboratory and field experiments［J］.Environ Sci Pollut Res Int,2013,20（8）:5603-5614.

［17］曾春祥,王进军.吡虫啉亚致死剂量处理对桃蚜乙酰胆碱酯酶的时间与剂量效应［J］.植物保护,2007,33（2）:50-54.

［18］高希武，Gorun,等.改进的Ellman胆碱酯酶活性测定方法介绍［J］.昆虫知识,1987,24（4）:245-246.

［19］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding［J］.Anal Biochem,1976,72:248-254.

［20］Thompson HM.Esterases as markers of exposure to organophosphates and carbamates［J］.Ecotoxicology,1999,8:369-384.

［21］Fairbrother A,Marden B T,Bennettt J K,et al.Methods used in the determination of cholinesterase activity.Cholinesterase-Inhibiting Insecticides［M］.Amsterdam:Elsevier.1991,35-71.

［22］马敏,张宾,李生才.星豹蛛乙酰胆碱酯酶活性测定条件的优化［J］.山西农业大学学报,2010,30（4）:325-328.

［23］刘晓宇,赫强,吴谋成,等.鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性测定及对有机磷农药的敏感性研究［J］.食品科学,2006,27（12）:71-74.

Establishment of optimization of assaying activity of head acetylcholinesterase from Apis cerana cerana

Wang Yuhao1，2Zhao Dongxiang1Wang Yujie1Liu Junfeng1Gao Jinglin1Liu Guiqiong2
（1 Environment and Plant Protection Research Institute,CATAS,Hainan Haikou 571101,China；2 College of Animal Science and Technology,Huazhong Agriculture University,Wuhan 430070,China）

Acetylcholinesterase is an important biochemical marker in insects,and its changes are usually used to monitor pesticide sublethal effects of insects.The conditions of acetylcholinesterase activity will change with different species or different parts of the same species In this paper,we identified the enzyme concentration,substrate concentration,pH,reaction temperature and reaction time by 25 combinations of orthogonal experiment.The five factors influence the specific activity of the head acetylcholinesterase of the Apis cerana cerana.The results showed that the order of the activity of acetylcholinesterase followed as concentration of protein＞temperature＞pH＞time＞concentration of substrate.And the optimal conditions were listed,such as enzyme concentration 0.25g protein/L, substrate concentration 0.8 mmol/L,pH 7.5,reaction temperature 40℃and reaction time 5 min.Above all,we optimized the conditions of A.cerana cerana head acetylcholinesterase,which will be helpful to the assessment of organophosphorus,carbamate and neonicotinoid insecticides.

Apis cerana cerana；Acetylcholinesterase；orthogonal experiment；optimal assay conditions

国家蜂产业体系儋州综合实验站建设项目（No.CARSSYZ-14）；海南省应用技术研发与示范推广专项（No.ZDXM2014050）；公益性行业（蜜蜂）科研专项子课题（No.201203080-8）

王宇豪（1990-），男，硕士研究生，研究方向为蜜蜂毒理学，E-mail:wang_yuh@163.com

高景林，E-mail:jinglin.g@163.com；刘桂琼，gnrh@qq.com