曹联飞　胡福良

（1浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州310021；2浙江大学动物科学学院，杭州310058）

浙江浆蜂及相近蜂种中W316片段的分布频率研究

曹联飞1胡福良2

（1浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州310021；2浙江大学动物科学学院，杭州310058）

为进一步阐明W316片段与王浆高产性状的相关性，本研究检测了浙江浆蜂、意蜂品系和卡尼鄂拉蜂中W316片段的分布频率。结果显示：W316片段在浙江浆蜂中的分布频率为77.8%，在意蜂品系中为52%，在卡尼鄂拉蜂中为45%，浙江浆蜂中W316片段的分布频率显著高于意蜂品系和卡尼鄂拉蜂，而意蜂品系与卡尼鄂拉蜂间差异不显著。

浙江浆蜂；W316；分布频率；RAPD

浙江浆蜂是20世纪60年代开始，浙江省杭嘉湖地区蜂农对饲养的意大利蜂长期定向选择，形成的具有王浆高产突出特征的蜜蜂遗传资源［1］。浙江浆蜂已被列入国家畜禽遗传资源目录。浙江浆蜂形成后，其王浆高产机理及相关的分子标记一直是业界研究的热点，学者们从形态学、细胞学、生化水平及分子水平等进行了相关研究。其中，王浆高产性状相关的DNA标记-W316片段的研究引起了较大关注［2］。然而同时，有人也对相关研究结果提出了质疑，认为实验的样本太少，用作对照的王浆低产蜂种的代表性也不够强［3］。

鉴于此，我们在浙江省杭嘉湖地区的平湖、萧山、长兴等地全面采集浙江浆蜂样品，同时从吉林省养蜂研究所建立的“国家级蜜蜂种质资源保护场”采集原意、美意、澳意、本意等意蜂品系样品及卡尼鄂拉蜂样品，借鉴前人关于W316片段的研究方法，检测和分析W316片段在浙江浆蜂及相近蜂种中的分布频率，以期进一步阐明W316片段与王浆高产性状的相关性，从而为王浆高产蜂种的选育提供参考。

1　材料与方法

1.1实验材料

浙江浆蜂：浙江省平湖市15家蜂场共30群；浙江省萧山区6家蜂场共30群；浙江省长兴县5家蜂场共30群。

“国家级蜜蜂种质资源保护场”的原意蜜蜂10群、本意蜜蜂5群、澳意蜜蜂5群、美意蜜蜂5群，以及卡尼鄂拉蜂20群。

1.2实验方法

1.2.1DNA提取

取酒精浸泡保存的蜜蜂样品，每群随机取一只工蜂，剪取蜜蜂胸部肌肉，按照细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的说明和步骤提取总DNA。

1.2.2RAPD-PCR扩增

参考前人文献［2］，使用随机引物W（引物序列：5’-CGGCCCCGGT-3’）进行RAPD-PCR扩增反应。反应体系20μl,其中10×buffer 2 μl，25mmol/L MgCl21.2 μl，2.5mmol/L dNTP 1.6μl，10nmol/L引物0.4μl，DNA模板2 μl，Taq酶（5U/μl）0.5 μl。扩增反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35个循环，最后72℃延伸10min,4℃保存。

1.2.3PCR产物电泳检测

扩增产物使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后固定、银染、显色,白光灯下拍照保存。Quantity One软件估测电泳图片中的片段大小，确定W316片段的电泳位置。统计W316片段在各个蜜蜂群体中的分布频率。

2　结果与分析

2.1RAPD-PCR产物电泳结果

部分样品的电泳图谱见图1。红色箭头所指位置即为W316片段的电泳位置。

图1　RAPD-PCR扩增结果（1-10道：平湖地区浙江浆蜂；11-20道：原意；21道：DNA Marker；22-26道：本意；27-36道：卡蜂）

2.2W316片段分布频率统计

浙江浆蜂样品中，平湖地区样品W316片段的分布频率为80%，萧山地区样品的分布频率为83.3%，长兴地区样品的分布频率为70%。浙江浆蜂总体的分布频率为77.8%。意蜂品系样品中W316片段的分布频率为52%。卡尼鄂拉蜂样品中W316片段的分布频率为45%。即W316片段的分布频率在浙江浆蜂中高于意蜂品系，意蜂品系高于卡尼鄂拉蜂。进一步统计分析显示浙江浆蜂与意蜂品系间、浙江浆蜂与卡尼鄂拉蜂间W316片段的分布频率差异显著，而意蜂品系与卡尼鄂拉蜂间差异不显著。

3　讨论

RAPD技术是20世纪90年代发展起来的一种DNA多态检测技术，由于其简便、经济、快捷，且无需事先了解物种的相关分子生物学信息，迅速广泛应用于系统发育研究、动植物物种鉴定、群体遗传分析、基因图谱构建、以及疾病诊断等诸多领域［4］。张雅娟等人［2］首次应用RAPD技术进行王浆高产性状分析，为浙江浆蜂的王浆高产机理研究及标记辅助选择育种提供了新的思路。本研究借鉴张雅娟等人的实验方法，扩大浙江浆蜂的样品数和采样范围，加入与浙江浆蜂亲缘关系较近的意蜂品系作为对照，同时采用分辨率更高的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而进一步分析W316片段与王浆高产性状的相关性。研究结果显示浙江浆蜂中W316片段的分布频率显著高于意蜂品系和卡尼鄂拉蜂。

值得注意的是，张雅娟等［2］的研究结果显示W316片段在王浆高产蜂种中存在，而在王浆低产蜂种卡尼鄂拉蜂中不存在。我们的研究结果显示W316片段在浙江浆蜂、卡尼鄂拉蜂和意蜂品系中都存在，只是分布频率有差异。分析原因可能与张雅娟等人实验中样品量太少造成的误差有关。金水华等人［5］2003年的研究结果显示，平湖市7家蜂场的30群浙江浆蜂样品中有28个样品存在W316片段，也说明W316片段在蜜蜂群体中存在分布频率的差异。

浙江浆蜂中W316片段的分布频率显著高于意蜂品系和卡尼鄂拉蜂。众所周知，浙江浆蜂的王浆产量也显著高于意蜂品系和卡尼鄂拉蜂。是否说明W316片段与王浆高产性状相关呢？还需要进一步研究和证实。首先，RAPD技术是使用随机引物进行扩增的，其扩增产物反映的主要是DNA的多态性，而扩增产物中各个DNA条带的本质和功能还是未知的，因此W316片段与王浆高产性状的相关性还需要确切的功能验证。其次，由于W316片段在蜜蜂群体中存在分布频率的差异，因此实验样品的数量和样品的代表性至关重要。本研究虽然比较全面的采集了浙江浆蜂样品，同时尽可能采集了意蜂品系等对照组样品，但是由于条件限制，样品数量尤其是对照组样品还偏少，样品的代表性还不够强。近年来，新一代生物技术突飞猛进，新技术在浙江浆蜂王浆高产性状的研究中必将发挥越来越大的致谢:感谢吉林省养蜂研究所牛庆生研究员、浙江省平湖市种蜂场金水华高级畜牧师、浙江省萧山区种蜂场杨国泉场长、浙江省长兴县种蜂场邱汝民场长等在样品采集过程中给予的大力协助！

作用。

［1］国家畜禽遗传资源委员会.中国畜禽遗传资源志-蜜蜂志［M］.北京:中国农业出版社，2011.

［2］张雅娟，蒋滢，王尉平，等.高产王浆西蜂的DNA特异标记-W316bp片段的研究［J］.中国养蜂.2001，52（3）: 7-9.

［3］李志勇.W316bp段为高产王浆标记质疑［J］.中国养蜂.2004，55（6）:17.

［4］张丕燕，谢庄，刘红林，等.RAPD技术及其在动物遗传育种中的应用［J］.生物工程进展.2000，20（4）:52～54，+51.

［5］金水华，潘永根，李新鑫，等.使用DNA特异基因标记-W316bp鉴定平湖王浆高产意蜂的研究再报［J］.中国养蜂.2004，55（2）:4～5.

The distribution frequency of W316 in Zhejiang royal jelly bee and related bee breeds

Cao Lianfei1Hu Fuliang2
（1 Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Zhejiang Academy of Agricultural Science,Hangzhou 310021,China；2 College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

To clarify the relationship between W316 fragment and high royal jelly producing trait,we determined the distribution frequencies of W316 in Zhejiang royal jelly bee,Italian bee and Carniolan bee.The results showed that the distribution frequency of W316 in Zhejiang royal jelly bee was 77.8%,while it was 52%and 45%in Italian bee and Carniolan bee.The results indicated that Zhejiang royal jelly bee had higher distribution frequency of W316 than Italian bee and Carniolan bee significantly.However,the difference was not significant between Italian bee and Carniolan bee.

Zhejiang royal jelly bee；W316；distribution frequency；RAPD

浙江省农业（畜禽）新品种选育重大科技专项项目（2012C12906-19）、浙江省农业科学院科技创新能力提升工程项目资助

曹联飞（1981-），男，博士，主要从事蜜蜂生物学和遗传育种研究，E-mail：caolianfei1981@163.com.

胡福良，教授，博导，主要从事蜜蜂科学研究，E-mail:flhu@zju.edu.cn.