李 勇 王莉华

郑州大学附属郑州中心医院神经外科 郑州 450000

研究表明miRNA 参与多种生物过程［1］，有许多关于miRNA 对神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）组织下调机制的研究的报道［2－3］。我们先前的研究发现miR－181c抑制NB细胞的生长，然而，miR－181c对NB 的靶向调控机制有待于进一步研究。

1 实验步骤

1.1 细 胞 系 和 转 染 人 类NB 细 胞 系SK－N－SH 和SHSY5Y。MiR－181c模 块，Smad7siRNA 和 反 义siRNA 购 买 于上海基因制造公司。基因编码Smad7放大和插入pcDNA3向量（上 游：5“CGAAGCTTATGTTCAGGACCAAACGATCTGCGC 3”；下游：5“CCCTCGAGGGGCGCAGATCGTTTGGTCCTGAACAT 3”）。使用Lipofectamine TM 2000细胞转染试剂（英杰公司）进行细胞转染。

1.2 绿色荧光蛋白报告基因分析 扩增Smad7的野生型3‘UTR，并插入到pcDNA3／EGFP媒介的下游。Smad7DE 突变体3‘UTR（UGAAUGA 突变为AGUAAGA）进行扩增，并克隆到载体pcDNA3／EGFP 的下游。对于EGFP 报告基因的分析，使用mir－181c模块或ASO－mir－181c和野生型Smad7的3＇UTR 或突变体3＇UTR 进行细胞共转染。RFP表达质粒转染效率增高。在转染48h后，通过一个F－4500荧光分光光度计来测定裂解的细胞和GFP密度。

1.3 免疫蛋白印迹分析 在6孔板中培养细胞，密度为30×104个细胞／孔，并且在第2天细胞数量达到大约80%的时候进行细胞转染。转染后48h，用RIPA 缓冲液，在4度裂解细胞30min。使用BCA方法测定蛋白质浓度并且用20μg的蛋白质上样来进行SDS－PAGE分析。一抗是兔抗人Smad7的抗体（1：500，Abcam 公 司，美 国）和 兔 抗 人GAPDH 抗 体（1：1 000，Abcam 公司，美国）。二抗是羊抗兔IgG 结合辣根过氧化物酶（1：1 000，Abcam 公司，美国）。使用的ECL Plus Western印迹检测系统（GE Healthcare）检测结合的抗体，并使用高性能的化学发光膜（GE Healthcare）上进行检测。

1.4 RNA 的提取和实时定量PCR 根据制造商的说明方案，使用Trizol提取总的RNA。使用1μg的RNA 进行逆转录。对于miRNA 的逆转录反应，使用特定的miR－181c RT 引物，然后用于总RNA 的逆转录，Oligo（dT）作为一个通用的引物。使用SYBR GreenPCR 混合物进行实时定量PCR。所有使用的引物如下：miR－181cRT primer：5’CTCAAC TGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCACCG 3’；miR－181c forward primer：5’ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACCTG 3’；Reverse primer：5’TGGTGTCGTGGAGTCG 3’；Smad7sense：5’TCTGCTCCTGGATCTCCCTGA GATG 3’；Smad7antisense：5’GCTTGCTGGCCTAATAGCAGAGCTT3’。

1.5 肿瘤细胞存活实验（MTT） 铺96孔板，4000个／每孔转染细胞。在转染48h 后，用MTT 培养4h。加入DMSO100μL，解除MTT 并将细胞放置摇晃10min。用分光光度计测定吸光值A（波长570nm）。细胞增殖率（%）＝ATest／AControl×100%。

1.6 Transwell小室迁移试验和侵袭试验 无血清培养基培养24h，消化细胞并离心收集细胞，细胞悬液（细胞密度2.5×104）250μL 加入transwell上室，腔室底部则加入750μL的含有10%～20%血清的培养液。20h后取出transwell小室，使用棉签轻轻擦拭小室上层细胞，使用4%多聚甲醛固定transwell小室。取出固定好的小室，使用自来水冲洗小室，结晶紫染色15min冲洗。将染好色的小室经梯度酒精脱水，风干后取下膜层，用中性树脂封片，显微镜下计数即可。

1.7 统计学分析 数据分析选用SPSS 13.0软件，所有数据采用mean±SD，两组间比较采用双样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mi－181c的直接目标基因Smad7 为了探索mir－181c对NB 细胞的调控机制，使用生物信息学技术我们预测了mi－181候选目标基因，认为候选基因对癌有潜在作用。我们挑选了Smad7，MAT2A，CDKN2AIP，TGFB1 当作候选靶向基因。为了确定这些基因是否被mir－181c调控，我们首先检测mir－181c控制3＇UTR 段绿色荧光蛋白的（Green Fluorescent Protein GFP）强 度。如 图4B 示，mir－181c 减 少3＇UTR 段Smad7、CDKN2AIP 和TGFB1 的GFP 强 度，而MAT2A 除外。另外，蛋白印迹法（Western blot）分析表明，mir－181c蛋白水平上减少对Smad7 和CDKN2AIP 的表达，而对TGFB1 和MAT2表达增高。鉴于mir－181c对Smad7的表达影响较CDKN2AIP显著，我们选择了Smad7作为进一步 研 究 对 象。Figure 1D 示，mir－181c 的 结 合 位 点 在Smad7 3＇UTR，而且产生了多个突变位点。我们用mir－181c对野生型／3＇UTR 段突变的Smad7重新转染细胞，发现mir－181c减少Smad 3＇UTR 段GFP强度，对突变的Smad7 3＇UTR段GFP强度没有影响。在蛋白水平上，mir－181c对Smad7 mRNA 的表达减少约40%。这些数据表明mir－181c直接靶向作用于Smad7，mir－181c可抑制Smad7的表达。

图1 mi－181c的直接目标基因Smad7

2.2 Smad7 介导mir－181c在NB 细胞中的抗肿瘤作用Smad7作为mir－181c的直接靶向基因，我们试图确定mir－181c是否引诱Smad7可以调节其生物学行为，我们用mir－181c模块和Smad7 过度表达载体pcDNA3／Smad7（无Smad7 3＇UTR）共同转染细胞发现，两者均能控制Smad7表达量。通过Western blot和RT－PCR 验证了Smad7 的表达。MTT 和Transwell侵袭实验分析表明，Smad7过度表达可以恢复细胞活力，促进迁移和侵袭能力。对修复细胞活性，迁移和入侵能力。此外，进一步验证Smad7在NB 细胞中的作用，我们用siRNA 技术抑制了Smad7的表达。我们发现Smad7的敲除抑制细胞的生长，迁移和入侵。总而言之，这些数据表明，Smad7 蛋白可能作为的mir－181c在NB肿瘤发生的重要介质。

图2 Smad7介导mir－181c在NB细胞中抗肿瘤作用

3 讨论

先前关于miR－181家族靶标基因研究主要是5p段结合位点干扰基因的研究［4］，最近研究人员用信息预测靶点法预测结合位点，进一步用突变3′段绑定结合位点干扰基因表达，检测靶点位目的基因表达率，发现miRNA－9靶定MMP－14基因3′段，并抑制其表达，对NB 起到抑制作用［5］。miR－181簇在癌症中起到的不同作用主要取决于它的靶向基因，通过靶向基因调节miRNA 的功能。为了了解mir－181c在NB细胞系中的抑癌作用机制，进一步研究靶向结合位点和碱基突变对基因表达的影响，本实验用EGFP 检测3＇UTR段Smad7绿色荧光蛋白（GFP）强度，发现mir－181c结合位点在Smad73＇UTR 段，而且有多个结合位点（本研究发现有6个结合位点，Smad73＇UTR1460－1466），而且发现mir－181c对突变的Smad73＇UTR 段GFP 强度没有影响（图1），验证了Smad7是mir－181c的直接靶向基因，并确定了3＇UTR 段靶向位点，进一步明确mir－181c对Smad7起负表达作用。

通过功能研究（图2），证实Smad7 和pcDNA3／Smad7（Smad7超表达载体－无Smad7 3＇UTR）对NB细胞促进生长，迁移和入侵作用。本实验两个细胞系均转染Smad7和pcDNA3／Smad7后MTT／Transwell结果示对NB细胞有积极作用，重要的是mir－181c－mmics＋pcDNA3 组对NB细胞的抑制作用最显著，说明mir181c与超表达的Smad7 起到抑制NB细胞生长，迁移和侵袭作用，由此可以说明Smad7直接诱导mir－181c产生抗肿瘤作用。然而，以往研究结果表明，Smad7在EGF信号通路中起负性调控作用，在乳腺癌中抑制TGF－β1的表达，从而抑制肿瘤细胞生长［6］，与本次实验数据形成了鲜明的对比。这个结果表明，Smad7 具有组织特性，在不同肿瘤中起到不同的作用。由此我们可以假设，mir－181c可能在乳腺癌和NB中起到不同的作用。

实质性证据表明，Smad的肿瘤抑制作用与TGF－β信号通路有关。Smad7在恶性肿瘤演变过程中的扮演不同的角色（抑癌／促癌）。Smad7通过防止信号转导复合物的活化抑制TGF－β1通路［7］。Smad7具有竞争性抑制作用外，还能够调节TGF／BMP 通路中Smurf遍在蛋白。Smurf2 连接到Smad7蛋白，降低信号传导，进而调节Smad7的遍在蛋白化和降解Smad。然而，到目前为止Smad7的功能仍然不清楚。通 过抑 制TGF－β，Smad7 过 度 表 达 抑 制 骨 和 肺 转 移［8－9］。Smad7同时通过减少MMP－2和MMP－9的分泌［10］抑制黑色素瘤细胞的生长和肿瘤发生。与此相反，Smad7的可诱发大肠癌转移［11－12］。符合Smad7 在结直肠癌促转移作用，我们的数据还表明，Smad7蛋白促进NB 细胞生长，迁移和侵袭。因此，Smad7蛋白功能机制有待进一步研究。

总之，我们研究证明了mir－181c通过Smad7 的表达抑制，调控NB 细胞的生长和转移，充当一种肿瘤抑制基因。这些结果为基因治疗NB患者奠定了重要基础。

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